山茶油皂苷抗炎及抗菌作用研究

馮秋瑜，覃欽成，白燕遠*

(1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤醫藥與醫養結合人才小高地，廣西 南寧 530200)

山茶油在日常生活中是一種食用油，但是不少專家和學者經過實驗研究發現，山茶油具有很高的藥用價值。《本草綱目》記載山茶油具有潤腸、清肺、祛痰等功效，“茶油性寒涼，味甘平，潤腸通便，清熱化濕，潤肺祛痰，利頭目”。《綱目拾遺》認為其具有殺蟲潤腸等作用，能“潤腸清胃，殺蟲解毒”[1]。《農政全書》中描述山茶油“療瘡疥，退濕熱”。《中國藥典》將山茶油收錄其中，認為其是一種軟膏基質和注射用茶油的原料。現代臨床對山茶油的功效和作用進行研究，發現山茶油能夠降血壓、降血脂以及對心腦血管疾病的預防具有較好效果。同時，山茶油還能夠清熱解毒、殺菌、抵抗紫外線，能夠有效預防皺紋和曬斑，所以也常將其應用于皮膚科的治療中[2]。隨著人們對自然的崇尚，天然抗菌以及抗炎劑的開發成為近年來臨床關注的熱點[3-4]。本實驗重點研究山茶油抗菌消炎的活性成分，深入開發山茶油作為皮膚科用藥的應用領域，助推廣西山茶油產業化發展，使山茶油的應用價值得到更充分體現。

1 材料與方法

1.1 動物

共48只實驗小鼠，均購自廣西醫科大學動物中心，合格證號：SCXK(桂)2020-0031，雌雄各半，適應環境飼喂5～7 d。

1.2 山茶油皂苷制備

由廣西中醫藥大學壯瑤藥重點實驗室黃慧學副教授通過乙醇熱回流方法提取得到，經測定皂苷含量為66.3%。

1.3 供試菌種

大腸埃希菌EC(Escherichia coli，購自廣東環凱微生物科技有限公司)；白色念珠菌MA(Monilia albicans，購自廣東環凱微生物科技有限公司)；腸炎沙門氏菌SE(Salmonella enteritidis，購自上海烜雅生物科技有限公司)；英諾克李斯特菌LM(L.monocytohenes，購自廣東環凱微生物科技有限公司)；須癬毛癬菌TM-p(Trichophyton mentagrophyte，購自上海烜雅生物科技有限公司)。

1.4 試劑

齊墩果酸(購自成都曼思特生物科技有限公司)；佛波酯(TPA，購自北京索萊寶生物科技有限公司)；TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯免疫吸附(ELISA) 試劑盒，均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.5 抗炎模型建立以及小鼠給藥方案

將48只小鼠隨機分為6組，分別為空白對照組，模型對照組，地塞米松組(采用地塞米松治療，劑量為2.5 mg/kg) 和山茶油皂苷低、中、高劑量組(劑量分別為10.0 mg/kg、20.0 mg/kg和40.0 mg/kg)。除空白對照組外，其余各組在小鼠右耳內外側涂抹20 μL佛波酯致炎。并于造模同時，地塞米松組、山茶油皂苷組小鼠均在右耳內外側涂抹相應藥液，每天1次，連續5 d，空白對照組和模型對照組小鼠涂抹等體積生理鹽水。

1.6 小鼠耳腫脹程度測定

小鼠給藥6 h后，采用厚度測定儀(數字測厚儀)對小鼠兩只耳朵的厚度進行測定，測量結果為每只小鼠測量2只耳朵的厚度差值。

1.7 小鼠耳朵組織中TNF-α、IL-6、IL-1β指標測定

取小鼠相同部位的耳組織，對其稱重，留作備用。然后取一定質量的耳組織，加入一定量生理鹽水，其中質量(g)∶體積(mL)=1∶9。將耳組織做剪碎處理，并制作成組織勻漿，濃度為10%，最后做離心處理。離心處理好后，根據ELISA試劑盒使用說明和操作步驟，對離心后的耳組織上清液進行分析，測量耳組織中3種指標的水平。

1.8 最小抑菌濃度(MIC)測定

根據微量肉湯稀釋法，將待測山茶油皂苷提取液過濾除菌，2倍稀釋法將其用培養基稀釋成80.000～0.001 mg/mL稀釋液。取微量稀釋板(96孔)，每孔加入50 μL稀釋樣品液以及菌懸液，以100 μL劑量的不加樣品液且含菌培養基作對照，每組3個平行。EC、SE、LM在37 ℃下培養18～24 h，MA在25 ℃下培養48 h，TM-p于25 ℃ 條件下培養7 d。觀察孔板測試菌生長狀態，與對照孔比較發現，菌生長被抑制，培養基清亮采用的最低藥物濃度值為山茶油皂苷最小抑菌濃度值。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 山茶油皂苷對小鼠耳腫脹程度的影響

與模型對照組相比，地塞米松組、山茶油皂苷組均能顯著降低小鼠耳厚度(P<0.05)，且山茶油皂苷高劑量組(40.0 mg/mL)耳腫脹抑制率與地塞米松組相當(P>0.05)，見表1。

表1 山茶油皂苷對小鼠耳腫脹程度的影響

2.2 耳組織中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量

山茶油皂苷高劑量能夠改善耳組織中炎癥細胞浸潤，減少TNF-α、IL-6、IL-1β含量，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 耳組織中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量

2.3 山茶油皂苷抑菌結果

山茶油皂苷對5個測試菌種均具有較好的抑菌能力，尤其是對須癬毛癬菌具有較優越的抑菌活性，MIC=0.005 mg / mL，詳見表3。

表3 山茶油皂苷抑菌結果

3 討論

山茶油渾身是寶，且具有明確的抗炎抗菌作用。在本研究中，采用TPA致小鼠耳腫脹模型對山茶油皂苷抗炎活性結果顯示，地塞米松和山茶油皂苷局部治療TPA致小鼠耳腫脹，均顯著降低了小鼠耳腫脹程度(P<0.05)，且山茶油皂苷高劑量組(40.0 mg/mL)耳腫脹抑制率與地塞米松組相當(P>0.05)，表明山茶油皂苷具有較好的抗炎作用。林朝悅等[5]采用角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹，經茶油治療后，發現其對于消除腫脹和抗炎效果較好。對研究結果進行分析，推斷出現這種結果的原因在于茶油對于小鼠體腫脹足內的丙二醛具有顯著降低效果，同時提高了SOD的整體活性，在抗炎的過程中可釋放出自由基，這有助于減輕小鼠體內組織的氧化反應。

人體炎性因子重要指標參數包括TNF-α、IL-6，前者主要出現在炎性反應初期，主要作用在于促進中性粒細胞、淋巴細胞的釋放，同時還可以促進IL-6釋放。TNF-α還作為反應炎癥程度的重要指標，直接反映患者體內發生炎癥的嚴重程度[6]。IL-6能夠活化蛋白激酶，從而影響到轉錄激活因子，對于炎癥反應的進程起到促進作用。IL-1β能夠促進免疫應答，也直接參與到人體炎性反應的過程中，提高了人體NK細胞的殺傷能力，有助于提高巨噬細胞產生IL-2、IL-6[7]。本實驗發現，山茶油皂苷的不同劑量組均能夠降低TNF-α水平，且差異有統計學意義(P<0.01)，其中中劑量、高劑量組可明顯降低IL-6、IL-1β水平(P<0.05)，表明山茶油皂苷的抗炎過程和作用機理可能與抑制炎性因子TNF-α、IL-6的正常表達有一定的關聯性，在一定程度上能夠有效抑制炎癥的惡性反應，有助于遏制炎癥反應過程，防止組織因為炎癥反應而進一步損傷。

山茶油具有一定的抑菌效果，常應用于細菌、霉菌、酵母的抑菌過程中。大量臨床研究發現，其對不同菌種的抑菌濃度不盡相同，如對金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、大腸埃希菌、黑曲霉和米曲霉、枯草芽孢桿菌的濃度值分別為3%、1%、4%、3%和7%[8-9]。抑菌效果與氨芐青霉素相同，同時其熱穩定性較高，不受pH差異影響。本實驗選擇代表性菌種做試驗，結果表明山茶油皂苷對環境有害菌具有抑菌能力，尤其對須癬毛癬菌效果最好，MIC為 0.005 mg/mL，因此，山茶油皂苷對有害菌具有較好抑菌活性。

除了具有抑菌、抗炎效果，山茶油還具有促進藥物吸收的功效。王愛萍等[10]發現山茶油可直接影響皮膚結構，對皮膚的屏障效果具有減弱效果，滲透性強，這樣有助于藥物通過皮膚吸收。研究發現山茶油的組織成分與人體皮膚較為類似，所以兩者的相容性較好，無刺激性[11]。相關研究顯示，山茶油能夠促進氟比洛芬在皮膚組織中的吸收率，從而有效提高藥物經皮滲透能力[12，13]。

綜上所述，山茶油皂苷在體外顯示對TPA致小鼠耳腫脹模型具有較強的抗炎作用，可能與抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β合成與釋放有關，并對多種菌有一定抑菌作用。