碘液浸染在Micro-CT下識別小鼠顱底-顳下區腫瘤組織中的應用

楊 榕，李慶祥，王逸飛，周 聞，王 雯，郭傳瑸，劉 浩△，郭玉興△

(1.北京大學口腔醫學院·口腔醫院，口腔頜面外科 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室，北京 100081；2.北京大學口腔醫學院·口腔醫院中心實驗室，北京 100081；3.河北醫科大學口腔醫院正畸科，石家莊 050017)

顱底-顳下區腫瘤位置深在，毗鄰溝通顱內外的頸內動、靜脈和Ⅸ～Ⅻ顱神經[1]，在臨床操作時入路困難[2-3]。采用CT影像技術，尤其是增強CT技術經導航設計軟件行三維重建可以充分顯示腫瘤范圍和頸內動脈、頸內靜脈及顱頜面骨性結構，據此可設計穿刺活檢或腫瘤切除手術方案[4-5]，但手術過程中常無法對顱底惡性腫瘤進行充分的擴大切除，手術后常需輔以放療或化療，常見腫瘤復發和遠處轉移[6]。

為了更好地研究顱底-顳下區惡性腫瘤的腫瘤發生和生長特點，我們嘗試建立了顱底-顳下區惡性腫瘤小鼠模型。在利用Micro-CT分析動物模型時，雖然其可精確顯影礦化組織[7]，但由于軟組織對X線的衰減作用小，無法形成良好的軟組織對比度，因此無法對腫瘤及周圍軟組織實現有效評估。既往研究多采用對比增強劑(碘制劑及四氧化鋨等)浸染以提高軟組織分辨率[8]。本研究中我們嘗試利用組織滲透性強、毒性低、易于獲取的復方碘液進行顱底腫瘤小鼠標本浸染，顯著提升了軟組織觀察效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

12只BALB/c裸鼠4～5周齡，體質量14～16 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號為SCXK(京)2016-0011。達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)購自美國Gibco公司，10%(體積分數)胎牛血清購自美國HyClone公司，0.1 U/L青霉素和100 g/L鏈霉素購自美國Gibco公司，5%(質量分數)復方碘液購自山東臨沂永安化驗室，蘇木精-伊紅染液、兔抗人廣譜細胞角蛋白多克隆抗體(26411-1-AP)購自美國Proteintech公司，PV-9001兔二步法檢測試劑盒及二氨基聯苯胺顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。小動物超聲系統(VisualSonics Vevo?1100)購自加拿大，Micro-CT(西門子Inveon MM Gantry-STD)購自德國，影像數據分析軟件(iPlan 3.0 BrainLAB)購自德國。

1.2 動物模型建立

試驗方案獲得北京大學生物醫學倫理委員會審批通過(批準號：LA2018247)。試驗開始前1周，將小鼠在標準條件下飼養于北京大學口腔醫院實驗動物中心。頭頸鱗狀細胞癌細胞系WSU-HN6來自北京大學口腔醫院中心實驗室。培養箱條件為37 ℃、5%(體積分數)二氧化碳。

采用吸入式簡易麻醉儀以異氟烷對小鼠鎮靜麻醉后，將其固定于操作臺，采用小動物超聲行頜下區掃描，判斷頸部主要血管位置。然后用1 mL胰島素注射器，將20 μL含有2×106個的WSU-HN6細胞經右側頜下區注射至右側顳下窩區域。注射細胞時，左手固定小鼠頭部及背部，右手持注射器貼小鼠右側下頜骨下緣進針。進針深度約4 mm，緩慢注射細胞，完成注射后停頓30 s，快速撤出注射器避免針道腫瘤種植。細胞注射后每隔1 d觀察小鼠活動狀態，至第3周，小鼠經過量二氧化碳安樂死后脫頸處理。解剖小鼠頭顱標本，以4%(體積分數)多聚甲醛溶液固定24 h以上。

1.3 3.75%復方碘液浸染

將100 mL 5%復方碘液中加入300 mL蒸餾水，濃度稀釋至3.75%[9]。碘單質(I2)在水中的溶解度極小，但在碘化鉀(KI)溶液中可以與解離的碘離子(I-)結合形成穩定的I3-，即為復方碘液中的活性物質[10]。將固定后的小鼠頭顱標本使用3.75%復方碘液持續浸染4 d。

1.4 Micro-CT影像掃描及數據分析

小鼠頭顱標本固定后先行非碘液處理掃描，再經3.75%復方碘液浸染4 d后使用磷酸鹽緩沖液充分沖洗標本，重新行Micro-CT掃描[11]。兩次掃描條件一致，均為9 μm、60 kV、220 μA，掃描數據以DICOM格式存儲。以上兩組掃描的DICOM影像數據導入影像數據分析軟件，比較分析顱底腫瘤位置和顱骨完整性。

1.5 組織學評價

小鼠頭顱標本去皮后，采用20% (體積分數)乙二胺四乙酸脫鈣2～4周，經系列濃度乙醇脫水，石蠟包埋后行組織連續切片，層厚5～6 μm，以標準方法進行蘇木精-伊紅染色。采用非生物素即用型二步法免疫組織化學方法染色，檢測廣譜細胞角蛋白的表達。病理學切片采用光學顯微鏡及體視顯微鏡進行觀察、拍照。

2 結果

2.1 動物建模情況

在對12只小鼠進行細胞注射的過程中2只出現頸部血腫立即死亡，其余小鼠采用小動物超聲定期檢查，術后3周可見到兩側頜下區出現明顯不對稱，由此初步判斷腫瘤已經形成。采用過量二氧化碳進行安樂死處理后，以4%多聚甲醛固定頭部標本，進行后續檢查、分析。

2.2 Micro-CT掃描結果

用Micro-CT掃描非碘液處理的標本，發現小鼠顱骨整體不對稱，下頜升支內側可見部分壓迫吸收，顳骨鱗部骨破壞明顯，但無法辨別軟組織影像(圖1A、B)。經3.75%復方碘液浸染4 d后，在Micro-CT中可以清晰分辨軟組織影像。經過辨認咀嚼肌的分布走行輪廓，并與腫瘤細胞注射側進行比較分析，可見顱底腫物的主體位于下頜升支內側、顳骨鱗部下、外側，腫物經顴弓向側面部突出(圖1C、D)。

A,B,coronal and axial views of Micro-CT scan before compound iodine solution staining indicated the bony invasion on the right side of the skull base easily (white arrows),but couldn’t determine the tumor location precisely;C,D,coronal and axial views of Micro-CT scan after compound iodine solution staining,reflected the skull base tumor (red dotted lines) from the surrounded muscles easily.圖1 采用3.75%復方碘液浸染前后小鼠Micro-CT影像學表現Figure 1 Micro-CT images of nude mice before and after staining with compound iodine solution

2.3 蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學染色分析

蘇木精-伊紅染色觀察發現腫瘤與周圍軟組織結構界限清晰。免疫組織化學染色顯示腫瘤為上皮來源的鱗狀細胞癌，同時在顱骨破壞的區域可以看見多核的破骨細胞(圖2)。

A,H-E staining showed a mass of atypia epithelial cells from the skull base tumor specimen;B,human cytokeratin immunohistochemical staining showed that the tumor was epithelial-derived squamous cell carcinoma;C,H-E staining of the destruction region of skull bone,red box shows the bone tissue with empty bone lacuna,black dotted box was enlarged as the figure 2D;D,the polynuclear osteoclasts at the margin of skull base bone resorption indicated by red arrow.圖2 蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學染色觀察顱底腫瘤特點Figure 2 Skull base tumors of murine model verified using H-E and immunohistochemical staining

3 討論

我們的既往研究提示腫瘤與顱底位置關系、腫瘤惡性程度及腫瘤大小都是影響腫瘤預后的重要因素，而腫瘤局部復發是治療失敗最常見的原因[6]。為了更好地進行顱底-顳下區腫瘤的診斷及治療研究，需要建立顱底-顳下區腫瘤動物模型。查閱文獻后我們發現目前國內外并沒有顱底-顳下區腫瘤動物模型，為此我們嘗試建立了小鼠顱底-顳下區腫瘤動物模型。

在實驗結果評價過程中，我們發現Micro-CT掃描雖可清晰顯示顱骨形態及骨破壞的部位及程度，但腫瘤及周圍軟組織密度均一，無法辨別腫瘤的位置、邊界等結構特征。文獻報道碘制劑浸染是個理想的選擇，2009年Metscher[11]利用10%復方碘液對胚胎標本浸染后行Micro-CT掃描，取得了良好的軟組織分辨率，之后Jeffery等[10]及Wu等[12-13]學者研究顯示，將人體或動物標本浸染于3.75%復方碘液7 d后再行Micro-CT掃描即可取得穩定、清晰的肌纖維及脂肪等軟組織影像，其原理主要在于碘(I)元素具有較高的原子序數(53)及原子量(126.9)，可引起很強的X線衰減和電子背散射作用。軟組織浸染后，由于I3-與不同組織親和力不盡相同，導致碘元素分布差異，不同軟組織間的密度差異增大，從而使X線影像出現明顯差異[14]，彌補了軟組織在Micro-CT影像中的低對比度缺陷。我們發現經過3.75%復方碘液浸染小鼠頭顱標本4 d后再行Micro-CT掃描即可清晰辨認腫瘤、軟組織(主要為肌纖維和脂肪組織)及顱骨結構。

為了進一步驗證動物模型的腫瘤形成情況，我們隨之進行組織學觀察。蘇木精-伊紅染色可以證實顱底區確有腫瘤形成，且腫瘤靠近中心部位有壞死灶發生。同時我們還觀察到顱骨破壞區存在多核破骨細胞，為了明確所形成腫瘤與我們植入的腫瘤細胞是否來源一致，我們進行了人角蛋白的免疫組織化學染色。兔抗人廣譜細胞角蛋白抗體可標記人上皮細胞來源的腫瘤，其結果證實小鼠右側顱底區的組織團塊確為人源性上皮來源的鱗狀細胞癌。

以上證據表明經過我們的方法可以成功建立顱底-顳下區腫瘤動物模型。復方碘液浸染在Micro-CT觀察中有很重要的作用，它是一種組織滲透性強、毒性低、操作簡便且易于獲得的對比增強劑，可以幫助清晰分析腫瘤、相鄰顱骨及周圍軟組織形態，在腫瘤的骨侵犯研究中有著明顯優勢。對于顱底-顳下區腫瘤的特點還可以采用Micro-MRI進行檢測分析，但其無法顯示清晰顯示顱骨骨質特征，并且價格昂貴，所以普及率低，因此，我們建立的這種顱底-顳下區惡性腫瘤動物模型可以模擬臨床情況，根據腫瘤特點進行相應的放射治療、化學治療，采用3.75%復方碘液浸染后再行Micro-CT掃描可以很好地進行治療效果評價。