miRNA-191-5p與微管相關蛋白1輕鏈3及Beclin-1在膿毒癥急性肺損傷中的相關性*

郭壯波 張銳 李燕威

（1廣東省廣州市紅十字會醫院急診科 廣州510220；2廣東省廣州市紅十字會醫院中心ICU 廣州510220）

有研究表明,膿毒癥（Sepsis）是一種由感染引起的全身炎癥反應綜合征,嚴重者可致全身多臟器衰竭,甚至死亡[1]。其中急性肺損傷（Acute Lung Injury, ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS）是膿毒癥患者的重要死因,表現為患者出現急性呼吸衰竭,急性肺實質及肺血管損傷等[2]。有研究表明,自噬異常與多種疾病的發生相關,如癌癥、免疫系統疾病等[3～4]。自噬與膿毒癥的相關性也有多種研究證實,自噬對膿毒癥具有一定的內源性保護作用[5]。miRNA是一種非編碼RNA,長度多在20～24個核苷酸,主要通過競爭性結合mRNA并抑制其翻譯而發揮作用,并在多種疾病的發生發展中發揮著重要作用[6]。有研究表明,miRNA-191-5p在腫瘤及神經系統疾病中發揮著重要作用,在膿毒癥急性肺損傷中的作用尚無相關研究,所以本研究旨在通過檢測臨床膿毒癥急性肺損傷患者血清miRNA-191-5p表達量與自噬相關蛋白微管相關蛋白 1輕鏈 3（Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3, MAPLC3）及Beclin-1的相關性,分析其對膿毒癥急性肺損傷患者的影響。現報道如下:

1 資料與方法

1.1 一般資料以及血樣采集 本研究經我院醫學倫理委員會批準,所有患者及家屬簽署知情同意書。選取2017年1月～2019年5月收治的確診為膿毒癥急性肺損傷患者80例,住院期間接受標準化治療。記錄所有患者年齡、性別、體質指數、心率、呼吸及體溫,采集患者入院第2天空腹靜脈血10 ml于血清分離膠采血管,上下混勻,靜置20 min,3 000 r/min離心5 min。在4℃環境中轉移血清于凍存管中,保存于-80℃冰箱待檢。

1.2 納入標準及排除標準 納入標準:符合膿毒癥診斷標準[7]；符合2012年ARDS柏林診斷標準[8],確認并發急性肺損傷。排除標準:其他系統并發器官衰竭；長期接受免疫治療；伴有肝臟、腎臟等重要器官疾病；患者及家屬拒絕入組。

1.3 主要試劑 PCR引物購自北京擎科新業生物技術有限公司。逆轉錄PCR試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TMII試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 qRT-PCR檢 測miRNA-191-5p、MAPLC3、Beclin-1在血樣中的表達量 4℃環境處理血樣,加入1 ml Trizol溶液（invitrogen公司）進行RNA裂解血樣,按照Trizol說明書提取血樣總RNA,然后使用nanodrop測定RNA的濃度以及純度,純度在1.8～2.2可用。使用TaKaRa公司的逆轉錄試劑并按照產品說明書合成cDNA以備用。見表1。實時定量PCR反應體系,反應體系包括:2×SYBR Green Qpcr Master Mix 10μl,1μl上游引物,1μl下游引物,7μl的ddH2O,1μl的模板cDNA,總反應體系20μl。

表1 引物序列表

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0統計學軟件分析數據,計量資料采用（±s）表示,應用t檢驗,計數資料采用%表示,應用χ2檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-191-5p表達量經檢測,患者miRNA-191-5p表達量分布如下。見圖1。根據miRNA-191-5p表達量中位數,分為miRNA-191-5p高表達組和低表達組,每組40例。

圖1 miRNA-191-5p表達量分布

2.2 miRNA-191-5p高表達組和低表達組一般資料比較 經檢測,兩組患者的基線資料如下,兩組患者在年齡、性別、體質指數、心率、呼吸及體溫比較無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表2 miRNA-191-5p高表達組和低表達組一般資料比較(±s)

表2 miRNA-191-5p高表達組和低表達組一般資料比較(±s)

指標 miRNA-191-5p高表達組（n＝40）miRNA-191-5p低表達組（n＝40） t/χ2 P年齡（歲）性別（例） 男女體質指數（kg/m2）心率（次/min）呼吸（次/min）體溫（℃）40.56±19.87 21 19 20.34±2.87 90.45±3.45 30.87±4.56 38.38±4.16 41.08±18.45 18 22 20.38±3.08 91.03±2.87 31.05±5.02 38.65±3.85 0.121 3 0.450 0 0.060 1 0.817 4 0.167 9 0.301 3 0.903 8 0.502 0 0.952 2 0.416 2 0.867 1 0.764 0

2.3 miRNA-191-5p高表達組和低表達組的MAPLC3、Beclin-1表達量 分別檢測miRNA-191-5p高表達組和低表達組MAPLC3及Beclin-1及表達量。見圖2。miRNA-191-5p高表達組的MAPLC3、Beclin-1表達量均高于miRNA-191-5p低表達組,差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 MAPLC3表達量

圖3 Beclin-1表達量

3 討論

膿毒癥多因感染引起,導致機體功能紊亂,多器官發生衰竭風險,其中肺臟最易受損,所以膿毒癥急性肺損傷或者進展為急性呼吸窘迫綜合征是臨床較常見的癥狀,加大了臨床治療膿毒癥的難度,患者死亡率也有所增加[9]。miRNA是一種長度20～24個核苷酸的非編碼RNA,可以通過與mRNA競爭性結合,調節下游基因的轉錄及翻譯,從而參與多種生物進程,在多種信號通路中發揮重要作用,與多種疾病的發生發展相關。自噬廣泛分布于機體,參與維持機體代謝平衡、物質代謝與更新等,并且會隨著機體變化有相應的適應[10]。自噬可以促進物質的循環利用,對破損細胞器進行清除,有效促進細胞的內環境穩態。Beclin-1是酵母自噬相關蛋白基因（Autophagy-related Gene, ATG）6同系物,MAPLC3是ATG8基因同源物,在哺乳動物體內調節自噬,Beclin-1調節自噬體的定位,MAPLC3調節自噬體的形成,可與自噬泡膜表面結合,二者可以作為自噬體的特異性標志蛋白。miRNA作為一種在真核生物中的發揮結合抑制作用的單鏈非編碼RNA,在人體內廣泛存在[11]。已有多種研究發現早期膿毒癥患者中的miRNA與自噬相關,但miRNA-191-5p的相關研究還沒有。本研究通過應用RNA提取、RNA逆轉錄、熒光定量PCR檢測膿毒癥急性肺損傷患者miRNA-191-5p與MAPLC及Beclin-1表達水平,并進一步分析其表達量之間的相關性。本研究發現,miRNA-191-5p的表達量與MAPLC及Beclin-1 mRNA表達水平相關。說明miRNA-191-5p可能與自噬相關,高表達量可以促進自噬發生。MAPLC及Beclin-1是用于監測自噬水平的重要標志物。自噬可以調節機體的炎癥反應,當膿毒癥發生時,機體受到重創,更高的自噬水平可以保護機體,協助機體調節自身狀態,促進機體穩態的恢復,保持內環境穩定。除此之外,自噬的發生發展與很多信號通路相關,之前有研究表明mTOR信號通路可能與自噬的調節有關[12]。本研究結果提示miRNA-191-5p與MAPLC及Beclin-1在膿毒癥急性肺損傷相關,為后續研究提供了一定的基礎,miRNA-191-5p有希望成為膿毒癥急性肺損傷進一步治療的靶標。

綜上所述,miRNA-191-5p在膿毒癥急性肺損傷中與微管相關蛋白1輕鏈3及Beclin-1相關。