氧化應激與細胞自噬凋亡對卵巢早衰調控的研究進展

楊開鋒 李蘭 周虹 肖小芹 劉慧萍

〔摘要〕 卵巢早衰是導致女性不孕的主要原因，研究證實氧化應激與卵巢早衰密切相關。氧化應激可以通過不同途徑介導細胞自噬和凋亡的發生，在卵巢當中，正常濃度的活性氧的有助于卵巢的發育和排卵，而過多的活性氧則會導致卵巢顆粒細胞和卵母細胞的過度凋亡，從而引發卵巢早衰。因此，減少卵巢的氧化應激，防止顆粒細胞過度凋亡，可為臨床防治卵巢早衰提供重要的研究方向。Nrf2-ARE信號通路是目前發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路，通過對Nrf2-ARE信號通路與卵巢早衰關系的總結，為卵巢早衰發病機制的進一步研究提供參考。

〔關鍵詞〕 卵巢早衰;氧化應激;Nrf2-ARE信號通路;細胞自噬;細胞凋亡

〔中圖分類號〕R285;R711? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.031

Advances on Regulation of Premature Ovarian Failure by Oxidative Stress and

Autophagy Apoptosis

YANG Kaifeng， LI Lan， ZHOU Hong， XIAO Xiaoqin*， LIU Huiping*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Premature ovarian failure is the main cause of female infertility. It has been confirmed that oxidative stress is closely related to premature ovarian failure. Oxidative stress can mediate autophagy and apoptosis through different pathways. In the ovary， normal concentration of reactive oxygen species contributes to ovarian development and ovulation， while excessive reactive oxygen species will lead to excessive apoptosis of ovarian granulosa cells and oocytes， thus triggering premature ovarian failure. Therefore， reducing oxidative stress and preventing excessive apoptosis of granulosa cells in the ovary can provide an important research direction for clinical prevention and treatment of premature ovarian failure. Nrf2-ARE signaling pathway is the most important endogenous anti-oxidative stress pathway found at present， and the relationship between Nrf2-ARE signaling pathway and premature ovarian failure is summarized to provide a reference for further study of the pathogenesis of premature ovarian failure.

〔Keywords〕 premature ovarian failure; oxidative stress; Nrf2-ARE signaling pathway; autophagy; apoptosis

隨著社會節奏的加快、女性心理壓力的增大及腫瘤放化療諸多不良因素的增加，卵巢早衰（premature ovarian failure， POF）患者數量逐年增加，且呈年輕化趨勢[1]。目前，遺傳、免疫、氧化應激、化學因素等是造成POF的最常見的影響因素，但其具體機制尚不清楚[2]。其中，氧化應激被認為是啟動或促進女性生殖疾病的關鍵因素[3]。其可能的機制為氧化應激誘導哺乳動物卵巢卵泡自噬、凋亡和壞死等多種細胞死亡途徑，導致卵巢多種退行性改變而造成POF[4-5]。通過闡明POF與Nrf2-ARE抗氧化通路和自噬凋亡通路之間的聯系，為POF的發病機制提供新思路。

1 POF與卵巢顆粒細胞的自噬、凋亡

自噬是真核生物通過降解多余或受損的細胞內物質來維持細胞穩態的高度保守的生物途徑[6]。在各種細胞應激條件下，自噬通過高度保守的分解代謝途徑，在能量或營養缺乏的情況下防止細胞損傷并促進存活，并對各種細胞毒性損傷作出反應[7]。因此，自噬主要具有細胞保護功能[8]，需要嚴格調節以正確響應細胞經歷的不同刺激，從而適應不斷變化的環境。自噬通過包裹一部分胞內物質形成自噬小體，在溶酶體的作用下進行降解并作為細胞內物質循環利用的重要途徑，這不僅有利于細胞的存活，而且在卵巢發育和疾病中也有著重要意義[9-10]。在某些情況下，自噬的過度激活亦會導致卵巢顆粒細胞的死亡。實驗證明，大鼠卵巢顆粒細胞中自噬體的積累可以降低B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）的表達而誘導顆粒細胞的凋亡，導致卵泡閉鎖并誘導POF的發生[11-13];此外，自噬亦可通過自噬誘導引起二型細胞程序性死亡，獨立于凋亡介導的一型細胞程序性死亡[14]，所以顆粒細胞自噬性死亡（二型細胞程序性死亡）亦有可能是導致POF的另一因素。

2 氧化應激與卵巢顆粒細胞的凋亡自噬

2.1? 氧化應激與卵巢顆粒細胞凋亡

氧化應激指機體內活性氧（reactive oxygen species， ROS）與抗氧化成分失衡而引起的一系列適應性的反應。在無外界刺激源的條件下，機體內ROS的產生和清除處于一種動態平衡，而當機體ROS含量相對升高，機體對其清除能力相對不足時，會使組織當中過氧化水平明顯升高，并導致機體受到損害。ROS由正常的生理過程產生，在細胞信號傳導和組織穩態中起著重要作用[15]。然而，過多的自由基物種也會對細胞成分產生不利的修飾，一是各種細胞成分的破壞，如蛋白質、脂類、DNA的損傷，二是觸發特定信號通路的激活，這兩種效應都可以導致細胞凋亡[16-18]?，F有研究[19]表明，ROS在細胞信號傳導以及線粒體、死亡受體和內質網（endoplasmic reticulum， ER）介導的凋亡主要途徑的調控中起著核心作用;實驗研究[20-21]證明，H2O2可以誘導內源性促凋亡相關分子（Bax、Bak）升高和抗凋亡分子（Bcl-2、Bcl-xL）的降低，并通過ROS-JNK-p53途徑調節卵巢顆粒細胞的細胞凋亡。

2.2? 氧化應激與卵巢顆粒細胞自噬

在生理狀態下，自噬對機體具有保護作用，ROS和氧化應激可以激活自噬，自噬通過負反饋作用保護細胞，有選擇地消除ROS的來源[22-24]，從而維持顆粒細胞的穩定。線粒體是機體內發生氧化反應的主要場所，這個過程伴隨著ROS的產生，然而過量的ROS會引起線粒體損傷[25-26]，釋放出凋亡因子引起細胞死亡。選擇性自噬通過去除受損的卵巢顆粒細胞當中損傷的線粒體，不僅可以幫助卵巢顆粒細胞生存，而且可以使ROS維持在一個相對較低的水平[27-29]。但是，在某些情況下，ROS引起的過度自噬也會導致自噬性細胞死亡。研究[30-33]表明，脂質過氧化可以加合到特定的線粒體和自噬相關蛋白中，以自噬細胞死亡的方式導致細胞功能障礙，而且脂質過氧化物還可誘導溶酶體功能障礙和脂褐素合成，導致自噬活性降低。脂質過氧化物可能通過不同的信號途徑觸發自噬細胞死亡。首先，脂質過氧化物可能通過AMP依賴的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase， AMPK）抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1， mTORC1）的活性啟動自噬，AMPK作為mTOR途徑的上游調節劑，可感知營養和能量消耗，激活結節性硬化復合物（tuberous sclerosis complex， TSC），抑制mTOR活性，并且提高微管相關蛋白2輕鏈3（microtubule-associated protein 2-light chain 3， LC3-II）的水平導致自噬[34-36];其次，脂質過氧化物可以使Bcl-2與c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）的相互作用，從而通過JNK途徑促進自噬[37]，JNK介導Bcl-2磷酸化，使得Bcl-2從Bcl-2/Beclin1復合體解離出來，參與自噬的溶酶體降解途徑，該途徑不會使mTOR通路失活，在Bcl-2依賴的自噬過程中起重要作用。生理性自噬可以抑制細胞凋亡，促進細胞存活;而病理性自噬會導致細胞程序性死亡，而不利于細胞存活，這主要取決于機體內氧化應激的程度和抗氧化水平。

3 Nrf2-ARE通路對POF防治的積極意義

3.1? Nrf2-ARE信號通路與氧化應激

Nrf2-ARE信號通路是目前認為最為重要的內源性抗氧化通路[38]。其中，抗氧化反應元件（antioxidant response element， ARE）是一種能編碼啟動子區域的多種解毒酶和細胞保護蛋白基因的增強子序列[39]。核因子NF-E2相關因子（nuclear factor erythroid 2 related factor 2， Nrf2）靶基因編碼的蛋白具有廣泛的細胞保護作用，包括抗氧化、解毒和抗炎，而Nrf2缺失或失活會使細胞對各種刺激的敏感性顯著上升[40-41]。Kelch樣ECH相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1）被鑒定為是一個Nrf2的E3泛素連接酶底物接頭，可導致蛋白酶體的快速降解[42]。Keap1確保了正常生理狀態下Nrf2蛋白的低水平，其半衰期僅為15～40 min。更重要的是，Keap1為含有高活性的半胱氨酸，一旦被親電分子修飾，就會阻止對Nrf2進行蛋白酶體降解，從而導致Nrf2蛋白在氧化應激下迅速積累，激活后的Nrf2進入細胞核，并與小肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物（sMAF）蛋白結合形成二聚體，并與順式作用元件ARE相結合，誘導基因表達，調節相關抗氧化物質保護細胞[43]。此外，蛋白激酶c、促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇激酶通過誘導Nrf2磷酸化也參與了Nrf2-ARE的通路激活[44]。

3.2? Nrf2-ARE通路抑制顆粒細胞凋亡

POF的一個主要原因是卵泡過度閉鎖，而卵泡過度閉鎖是由卵巢顆粒細胞凋亡所致，因此，顆粒細胞的正常生理功能對卵母細胞的發育起著至關重要的作用[45]。氧化應激可以通過不同途徑導致卵巢顆粒細胞凋亡，而Nrf2-ARE通路通過表達抗氧化相關產物如血紅素加氧酶-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶[46]等，通過降低ROS水平抑制細胞凋亡，促進顆粒細胞存活。其次，一旦Nrf2-ARE通路激活，便會誘導P62蛋白表達，從而降解Keap1蛋白，減少Bcl-2/Keapl相互作用，增加Bcl-2/Bax異二聚體，抑制顆粒細胞凋亡，保護卵巢功能[47-48]。Keapl在ROS誘導的細胞凋亡中發揮著重要的作用，Keapl不僅可以通過線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PGAM5）與Bcl-xL結合形成Keapl/PGAM5/Bcl-xL的復合體，而且還可以與Bcl-2蛋白結合形成Keapl/Bcl-2復合體，導致Bax的積累，增加線粒體細胞色素c的釋放，激活Caspase-3/7，增加了DNA的碎片化和凋亡[49-51]?？寡趸瘎┢茐牧薑eap1/PGAM5/Bcl-xL及Keap1/Bcl-2復合體的穩定性，促使Bcl-2、Bcl-xL的釋放，減少細胞凋亡。Nrf2信號通路在氧化應激誘導的細胞凋亡中發揮著重要的抗凋亡作用，而Nrf2信號通路在POF的治療中發揮的作用可進一步深入研究，為POF治療提供新依據。

3.3? Nrf2-ARE通路對顆粒細胞自噬的雙重調節作用

P62作為一種自噬銜接蛋白，結合泛素化蛋白聚集體并將它們傳遞給自噬體[52-53]。氧化應激誘導P62基因的表達是由NRF2-ARE通路介導的，P62與Keap1的相互作用，將Keap1固定到自噬體中，從而損害由Keap1介導的Nrf2的泛素化作用，導致Nrf2信號通路的激活[54-55]，形成了一個由自噬和keap1/Nrf2/ARE通路組合而成的抗氧化損傷的正反饋循環。線粒體自噬通過清除受損的線粒體，對維持卵巢顆粒細胞的正常功能至關重要，而Nrf2-ARE信號通路誘導P62表達，在介導線粒體自噬中有著重要的作用，通過降解老化或者受損的線粒體，不僅可以降低ROS水平，而且可以防止線粒體損傷而導致的顆粒細胞凋亡。此外，Nrf2-ARE信號通路通過表達相關抗氧化蛋白，抑制氧化應激導致的脂質過氧化而引起的病理性自噬[56-57]，防止卵巢顆粒細胞自噬性死亡。由于Nrf2信號通路和自噬相關通路的復雜性，目前尚不能完全理解所有的分子機制，但是通過調節氧化還原水平以達到自噬的穩態對POF的治療意義重大。

3.4? 中藥復方通過干預Nrf2-ARE通路治療POF的潛力

中醫學雖無卵巢早衰之病名，但可歸屬為“月經病”“不孕癥”范疇。目前，研究認為腎虛為POF的決定因素，血瘀為發病的關鍵環節，心肝脾為發病的重要環節。《黃帝內經·上古天真論》中指出：“二七而天癸至，任脈通……故有子”“七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，……故形壞而無子也”。天癸作為女性生育的關鍵物質基礎，而其充盈源于腎中之先天之精，并賴于后天水谷之精的滋養。正如《醫宗金鑒》所言“先天天癸始父母，后天精血水谷生”，所以治療POF最常用的方法是補腎健脾法。中醫學治療疾病往往通過扶正和祛邪兩個方面，而中醫藥治療POF“扶正”的分子機制尚不清楚，該機制有可能是通過調節Nrf2-ARE信號通路達到增強機體正氣的目的。現代藥理研究[58-61]表明，治療POF常用補腎健脾的基礎藥物，如黃芪、黃精、巴戟天、鐵皮石斛等，都具有抗氧化作用，其抗氧化的“扶正”作用機制極有可能與Nrf2-ARE信號通路的保護作用有關。中醫藥具有多靶點，對機體進行全面調控以維持穩態的作用，而目前對Nrf2-ARE信號通路與中醫藥的研究較少，加大這方面的研究可以更好地理解中醫藥及Nrf2-ARE信號通路在POF中的防治作用。

3.5? 其他

目前，研究認為導致POF的最可能的機制是氧化應激，然而使卵母細胞的數量減少和質量降低的具體分子機制仍值得探索，這種機制可能是通過氧化應激通路和自噬凋亡相關通路的相互交叉串擾導致的[62]。Nrf2可以作為卵巢細胞化學穩態的重要傳感器和調節劑，通過控制代謝排毒、ROS防御來保護細胞免受有毒化學物質的侵害[63]。且有研究[64]表明，通過口服富馬酸二甲酯（DMF）激活Nrf2-ARE信號通路來提高顆粒細胞的抗氧化能力，減少氧化應激和DNA損傷，從而改善小鼠卵巢中的卵巢儲備，保護卵巢功能。Nrf2信號通路的激活可以減輕卵巢顆粒細胞中氧化壓力[65]，這可以為克服年齡相關的生育能力下降提供新的見解。

4 展望

POF當前臨床治療主要方法是雌、孕激素人工周期替代療法，但臨床使用雌、孕激素有局限性，且不良反應較多。針對于POF在氧化應激、自噬、凋亡的復雜病因病機，可以通過對轉錄因子Nrf2的調控進行干預，Nrf2的激活可以產生有益的、全面的、多靶點的和持久的細胞保護效應。盡管目前還不能排除NRF2激活劑的致癌風險，但令人鼓舞的是，DMF的3期試驗的薈萃分析顯示，安慰劑組和DMF治療組之間的癌癥發病率沒有差異[66]。由于NRF2系統的特殊性使得藥物研發在監測參與靶點和靶外效應方面仍然具有挑戰性，而中醫藥在Nrf2信號通路與POF機制當中研究甚少，加大中醫藥與Nrf2信號通路的研究，毫無疑問可以為POF的防治提供一種新的思路。

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