曝氣條件對鐵基復合填料生物濾器脫氮性能及菌群變化的影響

隗陳征,劉鷹,任紀龍,馬洪婧,吳英海,韓蕊*

(1.大連海洋大學 海洋科技與環境學院，遼寧 大連 116023；2.設施漁業教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023)

將鐵基填料引入BAF中形成鐵-氮循環進而促進氮轉化被認為可以有效提高系統脫氮效率[8]。鐵循環和氮循環因互為電子供體和受體，可以通過生物作用和非生物作用耦合。海綿鐵填料引入水處理系統可通過吸附固定好氧、兼性厭氧和厭氧等細菌形成生物海綿鐵，并利用其特殊的化學性能增強系統脫氮性能。李杰等[9]通過將傳統活性污泥法中的填料替換為海綿鐵形成了生物海綿鐵體系，提高了系統的脫氮除磷能力。匡穎等[10]在海綿鐵與火山巖填料A/O生物滴濾池脫氮除磷試驗中研究證明，海綿體的引入提高了滴濾池的脫氮除磷能力。目前，已有對鐵-氮耦合的微生物機理研究，但其中多為針對自然環境和生活污水的處理研究[11-14]，而針對循環海水養殖廢水處理的研究較少。因此，通過對BAF中填料生物膜細菌群落進行擴增子測序，并對群落結構進行解析，揭示反應器細菌群落結構從而解析系統脫氮內在機理[15-16]，并定向調控脫氮功能細菌群落，對于降低養殖水體中氮素積累具有非常重要的意義。

本研究中，以生物海綿鐵與PPC凝膠親水填料形成復合填料，設置了不同曝氣運行方式，并通過16S rDNA高通量測序，研究了不同曝氣方式下不同填料上的細菌群落結構、豐度和多樣性等，探究了不同曝氣運行方式下系統脫氮性能及細菌群落變化，以期通過優化曝氣運行方式解析脫氮相關的細菌群落結構，提高BAF系統的脫氮性能。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗裝置如圖1所示，試驗用BAF為圓柱形(直徑10 cm、高60 cm)，有機玻璃材質，在BAF底部安裝有布水板以支撐填料和均勻布水。采用海綿鐵(購自河南希堯環保科技有限公司，粒徑0.5～5.0 mm，含鐵量大于95%)與PPC凝膠填料作為復合填料，海綿鐵與PPC凝膠填料配比為1∶3(質量比)，并使兩種填料混合均勻，用網兜固定，每個反應柱內填料總質量為900 g。通過時間控制器(AL-06，小耳朵電子科技有限公司)控制間歇曝氣時長，其中，柱A連續曝氣24 h，柱B曝氣12 h，間歇12 h，柱C曝氣0 h，系統進水為上流式，通過高位水箱進入系統。系統運行溫度通過加熱棒控制在(30.0±0.5)℃，水力負荷率(HLR)通過蠕動泵調控在1.2 m3/(m2·d)，碳氮比(C/N)為3∶1，pH為7.0±0.5。

A—24 h連續曝氣； B—12 h間歇曝氣； C—0 h曝氣； 1—海綿鐵與PPC復合填料； 2—溢流口； 3—高位水箱； 4—蓄水池； 5—蠕動泵； 6—氣石； 7—取樣口。

1.2 方法

1.2.2 試驗設計及取樣 待系統運行穩定后，從反應器最上方取樣口進行取樣。每次用50 mL的無菌離心管收集水樣50 mL。待系統穩定運行20 d后，在無菌條件下，分別將3個生物濾器中復合填料的海綿鐵和PPC凝膠填料手動分離，分別用無菌離心管收集，編號A1、A2、A3分別為曝氣24、12、0 h的海綿鐵填料，B1、B2、B3分別為曝氣24、12、0 h 的PPC凝膠親水填料，每個填料組設3個重復，取各組填料樣品置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于微生物群落結構測定。

η=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%。

1.2.4 DNA提取和16S rDNA高通量測序 采用十六烷基三甲基溴化銨法對樣本的基因組DNA進行提取，檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，采用16S V4區引物(515F 和806R)，使用帶Barcode的特異引物進行PCR擴增。高通量測序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 數據處理

基于Illumina Nova測序平臺測序，構建PCR-free文庫，然后進行雙末端測序。每個樣品設3個重復，通過對Reads拼接，平均每個樣品測得93 314條tags，經過質控平均得到87 852條有效數據，質控有效數據量達64 631，質控有效率達70%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，進行聚類時，先將序列按照豐度從大到小排序，通過97%相似度的標準聚類，得到16S rDNA OTU，每個OTU被認為可代表一個細菌物種(微生物物種)[18]。試驗中共得到5 353個OTUs，然后對OTUs序列與Silva132數據庫進行物種注釋，注釋結果中，共有2 009(38%)個OTUs注釋到屬水平。通過對不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha diversity 分析指數(Shannon、Chao1、ACE和good_coverage)進行統計。通過多變量統計學方法(unweighted unifrac)對距離進行主坐標分析PCoA(principal co-ordinates analysis)。基于unweighted unifrac 距離繪制熱圖用來評估微生物樣品組間的物種差異程度。

2 結果與分析

2.1 不同曝氣處理下的水質測定

圖2 不同曝氣處理下的去除率

圖3 不同曝氣處理下的質量濃度

2.2 16S rRNA高通量測序

2.2.1 細菌群落組成 從圖4可見：各處理組均是變形菌門Proteobacteria為優勢菌群，其相對含量約占總細菌組成的52.1%～80.1%，其次是厚壁菌門Fermicutes、擬桿菌門Bacteroidetes，分別占23.3%～0.9%、11.4%～0.1%，其他相對豐度較少的細菌屬為放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、硝化螺旋菌門Nitrospirae、浮霉菌門Planctomycetes等；A2組微生物組成與其他組差異較大，其變形菌門相對豐度最少，為52.1%，而厚壁菌門和變形桿菌門相對豐度最多，分別為23.3%和11.4%，芽孢桿菌綱Bacilli(10.3%)和梭菌綱Clostridia(11.4%)相對豐度均高于其他處理組；而與A2組在同一個反應器的B2組，變形菌門(80.1%)與γ-變形菌綱γ-Proteobacteria相對豐度均最多。

圖4 各處理組門水平和綱水平微生物組成

從圖5可見：在屬水平上，不同曝氣方式的細菌群落組成差異較大；A1組中亞硝化螺菌屬Nitrosospira相對豐度較大(6.6%)，A2組中的不動桿菌屬Acinetobacter(1.7%)、擬桿菌屬Bacteroides(6.9%)、代爾夫特菌屬Delftia(1.9%)和兼性厭氧的葡萄球菌屬Staphylococcus(5.3%)相對豐度均高于其他處理組，B2組中發光桿菌屬Photobacterium為優勢菌屬(相對豐度62%)；弧菌屬Vibrio在B3和B1組中大量存在(相對豐度分別為11.7%和10.5%)，而在A2和B2組中含量較低(分別為2.8%和4.8%)。

圖5 各處理組屬水平微生物組成

2.2.2 微生物豐度和多樣性結果 Alpha多樣性分析結果如表1所示，其中覆蓋率均在0.99以上，說明樣品文庫覆蓋率高，數據可靠，而A2組平均Shannon、Chao1和ACE指數均最大，平均值分別為7.44、2 396和2 484。

表1 0、12、24 h曝氣處理微生物的Alpha多樣性指數

從圖6(a)可見，第一、第二主成分對樣本差異的貢獻率分別為16.78%、12.37%，對于各樣本微生物群落構成的累計貢獻率為29.15%，A1組與B1組，A2組與B2組，A3組與B3組間存在較大差異。從圖6(b)可見：對于BAF的海綿鐵處理而言，A2組與A3組差異最大，相異系數為0.360，其次是A2組與A1組，相異系數為0.274；對于PPC填料處理，B1組與B3組差異最大，相異系數為0.145。

圖6 各處理組的Beta多樣性PCoA圖和矩陣距離熱圖

所有處理組共同擁有OTUs為1 106，占OTUs總數的49.1%，A2組特有OTUs數量為345，高于其他處理組(圖7(a))；海綿鐵填料處理組共同擁有OTUs為1 558，A2組特有OTUs數量最高為888，遠高于其他兩個處理組(圖7(b))；PPC填料共同擁有OTUs為1 487，B1處理組特有OTUs數量最高，為560(圖7(c))；海綿鐵填料處理組共同擁有OTUs數高于PPC填料處理。

圖7 總體韋恩圖、海綿鐵填料韋恩圖和PPC填料韋恩圖

3 討論

3.1 系統脫氮性能分析

3.2 曝氣生物濾器細菌群落結構分析

本研究表明，在門和綱水平上，不同間歇運行方式下海綿鐵填料和PPC填料細菌群落組成均存在差異，這說明不同的曝氣運行方式和填料類型均影響系統細菌群落組成，從而導致各處理組脫氮效果的差異。在不同填料細菌群落結構方面，海綿鐵填料處理組的厚壁菌門及芽孢桿菌綱相對豐度均高于PPC填料處理組，這說明海綿鐵填料結構更適宜好氧或兼性厭氧的厚壁菌門細菌生長。PPC填料處理組浮霉菌門和變形菌門相對豐度均高于海綿鐵填料處理組。目前，已知的厭氧氨氧化菌都屬于浮霉菌門，說明PPC填料表面更易富集厭氧氨氧化菌，對系統中氨氮轉化為氮氣并從系統中脫出起到關鍵作用[21]。本研究中，生物海綿鐵填料處理組的γ-變形菌綱含量均低于PPC填料處理組，以往研究也表明，大量好氧和兼性厭氧細菌屬于γ-變形菌綱，均為既能進行呼吸代謝又能進行發酵代謝的兼性異氧菌[3,22]，這說明鐵基填料會抑制γ-變形菌綱菌屬的富集。因此，海綿鐵和PPC填料形成的復合填料能夠富集廣譜脫氮相關的細菌群落，從而提高系統脫氮性能。

本研究表明，在屬水平上，不同間歇運行方式的細菌群落組成差異較大，其中，A2和B2組細菌屬水平組成與其他組存在較大差異(圖5)。A2組中大量存在的擬桿菌屬為污水處理中活性污泥的常見優勢屬，田道賀等[27]在研究硝化型生物絮團的馴化培養中發現，經過馴化擬桿菌屬成為硝化型生物絮團的優勢菌屬，其與硝化作用密切相關，進一步證明12 h間歇曝氣處理具有較強的硝化作用。A2組中相對豐度較多的不動桿菌屬[28]和代爾夫特菌屬也包含了部分好氧反硝化菌，其中，代爾夫特菌屬中的部分菌種具有良好的好氧反硝化能力[29]。兼性厭氧的葡萄球菌屬在A2組中相對豐度也較高，該屬中部分菌種屬于反硝化聚磷菌，通常具有良好的反硝化性能[30-31]。在B2組中發光桿菌屬為優勢菌屬(相對豐度為62%)，研究表明，該菌屬菌株能生長在含海水、D-葡萄糖和NH4Cl的無機培養基中，是一種兼性厭氧的化能異養菌，該屬部分菌株屬于好氧反硝化菌[32]。

綜上所述，12 h間歇曝氣運行條件使得系統能夠富集兼性厭氧及好氧脫氮功能菌，這是12 h間歇曝氣處理具有良好脫氮能力的原因之一。

3.3 組間共有及特有OTU分析

本研究表明，A2組OTUs數目最高，說明A2組的微生物多樣性高于其他組，這說明在間歇曝氣條件下營造出有氧-缺氧甚至厭氧的環境條件，適宜富集更廣氧氣耐受范圍的微生物群落。生物海綿鐵填料微生物多樣性高于PPC填料(圖7(a))，因為海綿鐵本身具有一定的除氧作用，可在系統中為各種好氧、兼氧和厭氧微生物的協同共生提供良好的“微環境”，在整個復合填料中，生物海綿鐵填料上的微生物是導致3個試驗組脫氮效果差異的主要微生物因素。A2組特有OTUs遠高于其他處理，進一步說明該處理組微生物多樣性最高，說明12 h間歇曝氣對海綿鐵填料上的微生物多樣性有利。在PPC填料處理中，B1組OTUs高于B2、B3組，這說明曝氣24 h處理在PPC填料上的微生物多樣性高于其他兩種曝氣運行方式，推測是由于PPC填料雖然與海綿鐵填料混合，但仍不會達到完全混合均勻的狀態，故在PPC填料內部的鐵離子遠遠少于海綿鐵填料上的鐵離子，所以PPC填料上的鐵氧化菌和鐵還原菌的數量小于海綿鐵填料，此時24 h連續曝氣對硝化作用的加強效果要比鐵-氮循環對微生物多樣性的促進效果強，導致B1組的生物多樣性高于B2組[33]。

3.4 微生物豐度和多樣性分析

3.4.1 Alpha多樣性分析 群落生態學中，通過樣品的多樣性分析(Alpha 多樣性)，可以反映微生物群落的豐度和多樣性[34]。根據測序公司提供的報告，Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高[7,24]。本研究中，A2組Shannon指數最高，這說明A2組的群落多樣性最高，與群落結構分析結果一致。Chao1指數和ACE指數反映微生物群落豐度，Chao1和ACE指數數值越大，表明樣本物種豐度越大。本研究中，A2組Chao1和ACE指數均最大(表1)。其原因可能是由于12 h曝氣處理通過間歇曝氣的方法在不同時段分別強化了硝化反應和反硝化反應，研究表明，與鐵-氮循環相關的鐵氧化菌和鐵還原菌的生長多伴隨著反硝化反應[35]，所以A2組的環境適合鐵氧化菌和鐵還原菌的生長，故12 h曝氣處理組中的細菌群落豐度和多樣性要高于24 h曝氣處理組。

4 結論

2)通過12 h間歇曝氣處理可改變生物濾器的內部環境，形成良好的好氧-缺氧交替環境，明顯提高了填料微生物多樣性，其中，海綿鐵填料上具備反硝化能力的不動桿菌屬Acinetobacter和代爾夫特菌屬Delftia，以及PPC填料上的發光桿菌屬Photobacterium相對豐度均有所提高，這些菌屬通過強化反硝化過程提升了系統整體脫氮性能。

3)由于鐵基填料的引入，在間歇曝氣條件下促進了鐵-氮耦合過程，使海綿鐵和PPC凝膠復合填料上富集了更多的反硝化菌，這是12 h間歇曝氣處理脫氮性能提升的原因之一。但是關于系統中鐵氧化還原調控氮轉化的機制仍需進一步研究。