牡蠣酶解產物改善睡眠作用效果研究

張婷，秦小明,2*，章超樺,2，曹文紅,2，鄭惠娜,2，高加龍,2，林海生,2

(1.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術研發分中心(湛江)，南海生物資源開發與利用協同創新中心，廣東 湛江 524088)

睡眠是人體的主動生理過程，可以恢復精神和解除疲勞。失眠是指難以入睡、夜間易醒及睡眠質量差等睡眠障礙問題[1],失眠對日間工作與生活影響較大，失眠會帶來身體免疫力下降、神經功能紊亂、記憶力減退等不良影響[2]。目前，治療失眠多以服用處方藥物為主，然而服用藥物常伴隨過量、依賴性及耐藥性等弊端[3]，因此，急需開發天然功能活性物質用于改善睡眠。

牡蠣廣泛分布于中國廣東、廣西等海域，屬于中國主要經濟貝類和四大養殖貝類之一，同時也是第一批納入藥食同源的食物，富含維生素、蛋白質等多種營養物質[4]。酶水解是從蛋白質來源獲得生物活性肽的有效方法[5]，研究表明，牡蠣的酶解產物具有免疫[6-7]、抗氧化[8]、創傷愈合[9-10]、抗疲勞[11]、改善學習記憶[12]、抗血栓[13]和抑菌[14]等功能活性，然而關于牡蠣改善睡眠的研究鮮有報道。牡蠣含有豐富的谷氨酸[15]，有助于促進γ-氨基丁酸的合成，同時，其具有較好的抗氧化能力，可以清除多余的氧自由基，對腦神經具有保護作用[16]。牡蠣還含有豐富的?；撬幔@是一種γ-氨基丁酸受體激動劑，有助于促進睡眠[17]。此外，牡蠣中有含量豐富的金屬元素鋅，其可以作為膳食補充劑從而改善睡眠[18]，這為開展改善睡眠研究提供了營養及理論基礎。本試驗中,采用動物蛋白酶對香港牡蠣Crassostreahongkongensis進行酶解，探究了牡蠣酶解產物(enzymatic products of oysters， EPO)對小鼠睡眠的影響，并初步探討了牡蠣酶解產物對睡眠的調節機制，以期為后續研究與產品開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用新鮮香港牡蠣購自廣東省湛江市東風市場。

試驗動物： SPF 級雄性KM小鼠200只，體質量為18～22 g(濟南鵬悅試驗動物繁育有限公司)，試驗動物生產許可證號為SCXK(魯)2019-0003，試驗動物使用許可證編號為SYXK(粵)2019-0204。

試劑： 動物蛋白酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司)、戊巴比妥鈉(Sigma公司)、地西泮(山東信誼制藥有限公司)、巴比妥鈉(國藥集團)、小鼠γ-氨基丁酸(GABA)ELISA 試劑盒、小鼠 5-羥色胺(5-HT)ELISA 試劑盒、小鼠褪黑素(MT)ELISA 試劑盒、小鼠多巴胺(DA)ELISA 試劑盒、小鼠去甲腎上腺素(NE)ELISA 試劑盒(江蘇酶免實業有限公司)。

儀器和設備： Lynx 6000 型高速冷凍離心機、Varioskan Flash多功能酶標儀(Thermo Scientific公司)、VAPODEST450全自動凱氏定氮儀(德國Gerhardt公司)、ATY124電子天平(日本島津株式會社)、PHS-3E型pH酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司)、 N-4000旋轉蒸發儀(埃朗科技國際貿易(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 牡蠣酶解產物EPO的制備 參照李婉等[19]的方法略做改進。將牡蠣肉與其3倍體積的蒸餾水進行勻漿，調節pH至7.0，加酶量為1 000 U/g，于53 ℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中酶解5 h，100 ℃沸水浴滅酶10 min，酶解液冷卻至室溫后，4 ℃下以 8 000 r/min 離心20 min，用紗布過濾去除雜質，取上清液進行濃縮，冷凍干燥。

1.2.2 EPO基本營養成分組成測定 參照GB 5009.3—2016、GB 5009.5—2016、 GB 5009.4—2016、GB 5009.6—2016、GB/T 9695.31—2008分別測定水分、粗蛋白質、灰分、粗脂肪和總糖含量。

1.2.3 EPO氨基酸組成測定 參照GB 5009.124—2016測定氨基酸組成。

1.2.4 動物分組及處理 試驗小鼠適應性喂養7 d后，隨機分組，每組40只，設陰性對照組 (灌胃等體積蒸餾水)、 陽性對照組 (灌胃地西泮2 mg/kg體質量)及EPO低、中、高劑量組(分別灌胃250、500、1 000 mg/kg體質量，分別記為EPO-L、EPO-M、EPO-H)。各試驗組每天灌胃一次，灌胃量為0.1 mL/10 g體質量，連續灌胃30 d。

1.2.5 直接睡眠試驗 陰性對照組、EPO各劑量組末次灌胃(第30天)后，觀察30 min內各組10只小鼠是否進入睡眠狀態。小鼠翻正反射消失(翻正反射消失是指小鼠處于仰臥位超過10 s不能恢復背臥位)超過1 min判定小鼠進入睡眠，小鼠恢復翻正反射判定為小鼠覺醒。統計陰性對照組、EPO各劑量組小鼠入睡數量[20]。

1.2.6 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗 各組小鼠末次灌胃1 h后，各取10只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg 體質量)，注射量為0.1 mL/10 g體質量。翻正反射消失到恢復的時間定義為小鼠睡眠時間，比較陰性對照組、陽性對照組、EPO各劑量組小鼠睡眠的時間[20]。

1.2.7 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗 各組小鼠末次灌胃1 h后，各取10只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質量)，注射量為0.1 mL/10 g體質量。觀察30 min，統計各組小鼠入睡數量并計算睡眠發生率[20]，即

睡眠發生率=入睡動物數/每組動物數×100%。

1.2.8 巴比妥鈉潛伏期試驗 各組小鼠末次灌胃1 h后，各取10只小鼠腹腔注射巴比妥鈉(300 mg/kg 體質量)，注射量為 0.1 mL/10 g體質量。注射巴比妥鈉到翻正反射消失的時間定義為睡眠潛伏期,比較陰性對照組、陽性對照組、EPO各劑量組小鼠睡眠潛伏期[20]。

1.2.9 神經遞質水平測定

1)腦組織勻漿液制備。各組小鼠末次灌胃1 h后，各取5只小鼠解剖，于冰上快速取其下丘腦、大腦皮層，稱重后分別與勻漿液PBS按照體積比為1∶9進行勻漿，4 ℃下以3 000 r/min 離心20 min，取上清液，測定5-羥色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、褪黑素(MT)，以及多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE)的含量。

2)指標的測定。根據小鼠5-HT試劑盒說明繪制5-HT含量標準曲線，標準曲線回歸方程為

y=0.006 3x+0.088 1(R2=0.992 6)。

根據小鼠GABA試劑盒說明繪制GABA含量標準曲線，標準曲線回歸方程為

y=0.249 3x+0.106 7(R2=0.985 2)。

根據小鼠MT試劑盒說明繪制MT含量標準曲線，標準曲線回歸方程為

y=0.02x+0.041 8(R2=0.999 2)。

根據小鼠DA試劑盒說明繪制DA含量標準曲線，標準曲線回歸方程為

y=0.011 9x+0.036 4(R2=0.995 6)。

根據小鼠NE試劑盒說明繪制NE含量標準曲線，標準曲線回歸方程為

y=0.175 6x+0.039 5(R2=0.998 7)。

根據各標準曲線，計算所測樣品的5-HT、GABA、MT、DA和NE含量。

1.3 數據處理

試驗結果以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，試驗數據采用SPSS 20.0 軟件進行分析，兩組數據采用獨立T檢驗法進行分析，多組數據采用單因素法(ANOVA)進行方差分析，睡眠發生率采用卡方檢驗法分析，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 EPO的基本營養成分

經測定，EPO基本營養成分中粗蛋白質含量最高，為(55.81±0.53)%，其次為總糖含量，為(30.83±0.35)%，粗脂肪含量為(8.72±0.20)%，灰分含量為(4.65±0.43)%，水分含量為(4.17±0.12)%。

2.2 EPO的氨基酸組成

從表1可見：EPO氨基酸組成種類齊全，必需氨基酸與氨基酸總和的比值為40.44%，符合FAO/WHO推薦標準中理想蛋白質模式，其中蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的占比分別為8.06%、6.39%、3.24%、6.44%、9.97%、5.67%、0.67%；EPO疏水性氨基酸與氨基酸總和的比值為60.37%，其中脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的占比分別為12.45%、7.20%、9.01%、6.39%、3.24%、6.44%、9.97%、5.67%。

表1 EPO氨基酸組成

2.3 EPO對小鼠直接睡眠的影響

從表2可見，末次灌胃30 min后，陰性對照組和EPO各劑量組小鼠均無直接睡眠現象，即EPO無直接睡眠作用。

表2 EPO對小鼠直接睡眠的影響

2.4 EPO對戊巴比妥鈉誘導睡眠時間的影響

從表3可見：陽性對照組、EPO各劑量組較陰性對照組均顯著延長了戊巴比妥鈉誘導小鼠的睡眠時間(P<0.05)；與陰性對照組相比，陽性對照組對戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間延長了89.82%，低、中、高劑量的EPO對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間分別延長了44.78%、74.52%、45.96%，其中EPO中劑量組相較于其他劑量組，可以較好地延長小鼠睡眠時間。這說明，在一定劑量范圍內，EPO與戊巴比妥鈉具有協同作用，可以延長小鼠睡眠時間。

表3 EPO對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響

2.5 EPO對戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠發生率的

影響

從表4可見，與陰性對照組相比，陽性對照組、EPO各劑量組的睡眠發生率均有升高，分別為80%、40%、70%、50%，其中僅陽性對照組、EPO中劑量組與陰性對照組有顯著性差異(P<0.05)。

表4 EPO對戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠發生率的影響

2.6 EPO對巴比妥鈉誘導睡眠潛伏期的影響

從表5可見，與陰性對照組相比，陽性對照組、EPO各劑量組均顯著縮短了小鼠睡眠潛伏期(P<0.05)，其中，EPO中劑量組可將睡眠潛伏期縮至最短。這說明，EPO與巴比妥鈉通過協同作用，可以顯著縮短小鼠睡眠潛伏期。

表5 EPO對巴比妥鈉誘導小鼠睡眠潛伏期的影響

2.7 小鼠下丘腦、大腦皮層的神經遞質水平含量

小鼠下丘腦神經遞質水平含量如表6所示，其中5-HT、GABA與MT為抑制性神經遞質，與陰性對照組相比，陽性對照組及EPO低、中劑量組下丘腦的5-HT和GABA含量均顯著升高(P<0.05)，EPO高劑量組5-HT和GABA含量略有升高，但無顯著性差異(P>0.05)，陽性對照組、EPO低、中劑量組MT含量有升高(P>0.05)；DA與NE為興奮性神經遞質，與陰性對照組相比，陽性對照組、EPO各劑量組DA含量均有顯著降低(P<0.05)，EPO低、中劑量組NE含量顯著降低(P<0.05)，陽性對照組、EPO高劑量組NE含量也有所降低，但無顯著性差異(P>0.05)。

表6 EPO對小鼠下丘腦神經遞質水平的影響( n=5)

小鼠大腦皮層神經遞質水平含量由表7所示，與陰性對照組相比，陽性對照組大腦皮層5-HT含量顯著升高(P<0.05)，EPO低、中劑量組5-HT含量略有升高，但無顯著性差異(P>0.05)；陽性對照組及EPO低、中劑量組GABA含量均顯著升高(P<0.05)，EPO高劑量組GABA含量略有升高(P>0.05)；陽性對照組、EPO各劑量組MT含量均高于陰性對照組，其中陽性對照組及EPO中、高劑量組MT含量有顯著性提高(P<0.05)；陽性對照組及EPO中、高劑量組DA含量均顯著降低(P<0.05)，EPO低劑量組DA含量略有降低(P>0.05)；EPO高劑量組NE含量顯著降低(P<0.05)，陽性對照組及EPO低、中劑量組NE含量略有降低(P>0.05)。

表7 EPO對小鼠大腦皮層神經遞質水平的影響( n=5)

3 討論

3.1 EPO營養成分對改善睡眠作用影響

本研究結果顯示，EPO蛋白質含量豐富，脂肪含量低，其中谷氨酸含量為1.17 g/100 g，占氨基酸總和的5.58%，甘氨酸含量為1.51 g/100 g，占氨基酸總和的7.20%。同時，基于課題組前期研究，相同制備方法下得到的牡蠣酶解產物微量元素中鋅含量最高，為440.67 mg/kg，?；撬岷繛?4.21 mg/g[16]。研究表明，甘氨酸可以通過血腦屏障進入大腦，通過作用于視交叉上核(SCN)中的NMDA受體，從而調節睡眠[21]；谷氨酸與?；撬峥梢源龠M抑制性神經遞質GABA的產生，鋅作為膳食補充劑可以起到改善睡眠質量的作用[18]。因此，EPO營養成分中相關氨基酸與微量元素能為改善睡眠提供營養支持。

3.2 EPO對小鼠行為學的影響

本研究中參照《保健食品檢驗與評價技術規范》[20]進行了EPO對小鼠睡眠影響試驗研究。直接睡眠試驗是為了探究EPO是否有直接睡眠效果；戊巴比妥鈉是一種作用于大腦中樞神經的藥物，通過肝酶代謝，腹腔注射戊巴比妥鈉后，若試驗組睡眠時間延長并與陰性對照有顯著性差異，即試驗結果為陽性，說明EPO與戊巴比妥鈉協同改善睡眠；為排除EPO對肝酶有抑制效果，造成假陽性的結果，進行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗，若試驗組睡眠發生率與陰性對照有顯著性差異，即試驗結果為陽性；巴比妥鈉也是對中樞系統有抑制作用的藥物，腹腔注射巴比妥鈉后，若試驗組睡眠潛伏期有顯著縮短，說明EPO與巴比妥鈉也有協同作用，試驗結果為陽性。本研究中，延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗顯示，2項試驗結果均為陽性，說明EPO具有改善睡眠的作用。該結果與Saito等[22]的研究結果一致。

3.3 EPO對小鼠下丘腦、大腦皮層神經遞質水平的影響

睡眠是一種晝夜活動，發生于大腦中，下丘腦、大腦皮層和海馬等神經組織結構與睡眠有著密切的聯系[23]。下丘腦位于丘腦下方，是高級神經中樞，下丘腦中包含大量神經元，主要為GABA能神經元、下丘腦腹外側視前核(VLPO)神經元和黑色素濃縮激素(MCH)神經元，這些神經元在促進睡眠中發揮著重要的作用[24]。大腦皮層中存在著大量的神經元細胞參與睡眠/覺醒調節，此外，大腦皮層神經細胞的波動可以產生慢波睡眠，有助于提高睡眠質量[25]。神經遞質分為興奮性神經遞質和抑制性神經遞質[26]。5-羥色胺(5-HT)，又名血清素，是一種抑制性神經遞質，研究表明，5-HT含量下降會導致不同程度的失眠[27]。γ-氨基丁酸(GABA)是神經中樞的主要抑制性神經遞質，由谷氨酸經過脫羧合成而來，GABA含量升高有利于睡眠時間的延長，催眠藥物都是基于GABAA受體進行調控睡眠[28]。褪黑素(MT)是一種由色氨酸合成的抑制性神經遞質，褪黑素可以縮短入睡潛伏期、延長睡眠持續時間及提高睡眠質量[29]。多巴胺(MT)是去甲腎上腺素的前體，是與睡眠有關的興奮性神經遞質，多巴胺可以調節情緒，并促進覺醒[30]。去甲腎上腺素(NE)也是促進覺醒的興奮性神經遞質，失眠狀態下，NE含量升高[31]。本研究中，與陰性對照組相比，EPO各劑量組中5-HT、GABA和MT含量的升高，可能與牡蠣中含有的谷氨酸、牛磺酸有關[16-17]，而EPO各劑量組中DA和NE含量的降低，可能與牡蠣中鋅含量豐富有關[18]。

4 結論

1)EPO可以提供改善睡眠相關的甘氨酸、谷氨酸等氨基酸及微量元素，并與戊巴比妥鈉協同延長小鼠睡眠時間，提高睡眠發生率，與巴比妥鈉協同縮短小鼠睡眠潛伏期，具有改善睡眠的作用。

2)EPO通過提高腦內5-HT、GABA、MT抑制性神經遞質含量，降低DA、NE興奮性神經遞質含量，起到改善睡眠的作用。

3)EPO 3個劑量均有改善睡眠的作用，其中用EPO 500 mg/kg體質量灌胃小鼠，改善睡眠效果最佳。