新疆克孜勒河厚唇裂腹魚人工繁殖及胚胎、早期仔魚發(fā)育研究

趙賀，洪繼彪，趙年樺，胡仁云，魏杰*，聶竹蘭

(1.塔里木大學 動物科學學院，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300； 2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300； 3.塔里木珍稀魚類研究中心，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300；4.武漢中科瑞華生態(tài)科技股份有限公司，湖北 武漢 430000)

厚唇裂腹魚Schizothoraxirregularis屬鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae裂腹魚亞科Schizothoracinae裂腹魚屬Schizothorax，是新疆克孜勒河土著魚之一[1]。克孜勒河位于中國最西端，隸屬于新疆維吾爾自治區(qū)克孜勒蘇柯爾克自治州，發(fā)源于天山南脈中吉邊界西側吉爾吉斯斯坦境內扎爾多布卡山口海拔4 419 m的冰山上，是喀什噶爾河水系中水量最大的一條河流[2]。近幾十年來，受氣候變化影響，克孜勒河流域內植被覆蓋率逐年降低，少有降水，加之人類對環(huán)境的破壞，厚唇裂腹魚生存環(huán)境日漸惡劣，種群數(shù)量急劇減少。

目前，關于厚唇裂腹魚的研究僅限于其資源分布[3-4]、形態(tài)學[5-6]、線粒體COI基因序列[7]、游泳能力[8]和精子活力[9]等方面，有關其人工繁殖、胚胎發(fā)育和早期仔魚發(fā)育方面的研究尚未見報道。本研究中，對克孜勒河厚唇裂腹魚親魚進行人工繁殖，探索厚唇裂腹魚的繁殖時期、雌雄鑒別、人工催產和人工孵化等技術，并系統(tǒng)觀察了其胚胎和早期仔魚發(fā)育的過程，以探究其胚胎和早期仔魚發(fā)育各個時期的典型特征，旨在為厚唇裂腹魚的資源保護和人工繁殖提供基礎資料和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年4—5月在新疆維吾爾自治區(qū)克孜勒蘇柯爾克自治州烏恰縣卡拉貝利水利樞紐工程魚類增殖放流站進行厚唇裂腹魚人工繁殖試驗。試驗親魚于2017年12月、2018年1—12月捕自克孜勒河流域，共捕野生親魚1 380尾，體長為152.31～271.25 mm,體質量為102.17～265.31 g，暫養(yǎng)于室內玻璃缸(直徑為2 m，水深為1 m)中，15 d后轉移至養(yǎng)殖池(面積≥667 m2，水深≥0.6 m，循環(huán)水≥1 m3)中進行培育。親魚培育過程中全程投喂飼料，飼料以漂浮料(成都海大6602)為主，鹵蟲和升索顆粒飼料為輔，日投餌量為魚體質量的2%～5%。

1.2 方法

1.2.1 親魚雌雄和成熟度鑒別 生殖季節(jié)雌魚形體明顯大于雄魚，腹部膨大柔軟，體表顏色相對雄魚較淺，臀鰭較肥厚；雄魚鰭條及身體顏色較鮮艷，臀鰭呈斜三角且末端尖形，形體修長，輕壓腹部有少量白色精液流出(圖1)。

圖1 繁殖期厚唇裂腹魚雌雄鑒別

1.2.2 人工催產 挑選3+齡雄性和4+齡雌性人工馴養(yǎng)成熟的親魚，雌雄親魚比為1∶2，使用2次注射進行催產。催產藥物為促黃體激素釋放激素(LHRH-A3)、馬來酸地歐酮(DOM)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，第1針注射LHRH-A34 μg/kg+DOM 3 mg/kg，間隔24 h后注射第2針(LHRH-A34 μg/kg+DOM 3 mg/kg+HCG 1 000 IU/kg)。為確定催產最佳水溫，水溫從16.0～19.5 ℃，設置8個梯度試驗，每組間隔為0.5 ℃，用溫控加熱棒控溫。每組雌魚10尾，雄魚20尾，每組設3個重復。

1.2.3 人工授精及孵化 至效應時間，采用人工干法授精，將成熟的魚卵直接擠入干燥的孵化筐(0.50 m×0.40 m×0.35 m)中，再將雄魚的精液直接擠到卵子上，用鵝毛輕輕攪動使二者充分混合。2 min后加入適量清水，受精卵吸水膨脹，25 min后再用清水清洗受精卵，轉入孵化缸(5.00 m×0.45 m×0.50 m)中孵化。每個孵化缸可放孵化筐5個，每筐可放卵粒5 000粒，孵化時受精卵在水下0.03 m。孵化進水管道連接軟管，在軟管另一端接上淋浴蓬頭，蓬頭固定在孵化缸水面上方0.50 m，蓬頭朝正上方方向噴水，噴出的水可距孵化水體水面0.90～1.30 m，淋水平均落差為1.10 m，水體交換量為0.11～0.22 m3/h。為確定受精卵孵化最佳水溫，水溫從16.0～19.5 ℃，設置8個溫度梯度試驗，每組間隔為0.5 ℃，用溫控加熱棒控溫。每組受精卵500 粒，每組設3個重復。

1.2.4 胚胎發(fā)育和早期仔魚發(fā)育觀察 選取同批次50粒受精卵進行胚胎發(fā)育觀察研究，利用顯微鏡(SMZ 1 270數(shù)碼體式)觀察受精卵發(fā)育各時期，以70%的受精卵進入相同發(fā)育時期作為一個發(fā)育期判定；選取同批次受精卵發(fā)育出膜的仔魚用于早期仔魚發(fā)育觀察研究，每次選取至少5尾仔魚，采用體積分數(shù)10%的福爾馬林溶液固定，在顯微鏡(CX31-32C02型)4×10倍鏡下進行觀察并記錄。

1.2.5 孵化效率評價

催產率=產卵魚數(shù)/催情魚總數(shù)×100%，

受精率=原腸中期活卵數(shù)/產卵總數(shù)×100%，

孵化率=魚苗水花尾數(shù)/受精卵總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(mean±S.D.)表示。使用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設為0.05。采用Excel 2020軟件進行早期仔魚的全長生長方程擬合。

2 結果與分析

2.1 厚唇裂腹魚人工催產和孵化的適宜水溫

從圖2可見：不同溫度下厚唇裂腹魚的催產率和受精率有顯著性差異；溫度對催產率影響試驗中，水溫為18.5 ℃時，催產率達到100%，當水溫低于18.5 ℃，催產率顯著下降(P<0.05)，因此，水溫維持在18.5 ℃左右時有利于親魚集中產卵，這也是提高催產率的有效途徑之一，可見最適催產水溫是18.5 ℃；溫度對孵化率影響試驗中，當水溫為17.0 ℃時，受精卵孵化率最高，達87%，水溫為17.5 ℃時，孵化率達到84%，溫度低于17.0 ℃或高于17.5 ℃時，孵化率顯著下降(P<0.05)，因此，其最適孵化水溫為17.0～17.5 ℃。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 厚唇裂腹魚胚胎發(fā)育

厚唇裂腹魚胚胎發(fā)育過程分為胚盤、卵裂、囊胚、原腸胚、神經胚、器官形成和出膜7個階段，劃分方法參考其他硬骨魚類[10]，整個發(fā)育過程劃分為18個時期(表1)。在水溫為(17.14±0.01)℃條件下，厚唇裂腹魚受精卵發(fā)育經過147 h 31 min孵化，總積溫為2 513.01 ℃·h。

表1 厚唇裂腹魚胚胎發(fā)育時序

2.2.1 受精卵胚盤形成時期 厚唇裂腹魚成熟卵為微黏性沉性卵、淺黃色、圓球形、半透明，卵徑(2.95±0.15)mm，吸水膨脹后達(3.53±0.12)mm(圖3A)，沉于水底。受精后2 h 27 min動物極出現(xiàn)明顯的胚盤，隆起高度約占卵黃的1/4(圖3B)。

2.2.2 卵裂階段 厚唇裂腹魚卵裂發(fā)生于胚盤，受精后3 h 26 min，胚盤中部形成分裂溝，將胚盤分裂為2個大小相近的分裂球，為2細胞期(圖3C)。受精后3 h 50 min，胚盤再次分裂，形成4個大小相近的細胞，為4細胞期(圖3D)。受精后4 h 56 min進行第3次分裂，形成8個大小相近的細胞，進入8細胞期(圖3E)。受精后5 h 47 min進行第4次分裂，形成均勻排列的4排16個細胞，且細胞體積明顯變小，此時期為16細胞期(圖3F)。受精后6 h 47 min進行第5次分裂，細胞體積進一步縮小，進入32細胞期(圖3G)。受精后7 h 17 min，第6次分裂完成，細胞團向上隆起，進入64細胞期(圖3H)。受精后8 h 42 min，細胞數(shù)量不斷增多，細胞團繼續(xù)向上隆起，細胞體積變小，此時受精卵進入多細胞期(圖3I)。

2.2.3 囊胚階段 受精后10 h 17 min，細胞數(shù)量急劇增加，細胞界限不明顯，胚胎發(fā)育進入囊胚早期(圖3J)。受精后10 h 35 min，胚胎發(fā)育進入囊胚中期，此時單個細胞體積較小，且無法分辨細胞界限，分裂球隆起高度達到最大，占卵球高度的1/3(圖3K)。受精后19 h 2 min，隆起高度逐漸降低，呈小帽狀，胚胎發(fā)育進入囊胚后期(圖3L)。

2.2.4 原腸胚階段 受精后36 h 1 min，分裂球細胞向植物極移動下包至卵黃高度的1/3，邊緣細胞排列平整，胚胎發(fā)育進入原腸胚早期(圖3M)。受精后38 h 14 min，胚層繼續(xù)下包至卵黃囊的1/2處，胚盾出現(xiàn)，進入原腸胚中期(圖3N)。受精后40 h 4 min，胚層下包至卵黃囊4/5處，胚盾伸長，胚胎發(fā)育進入原腸后期(圖3O)。

2.2.5 神經胚形成階段 受精后44 h 1 min，胚體出現(xiàn)并緊貼于卵黃囊上，前端膨大形成腦泡，胚胎發(fā)育進入神經胚期(圖3P)。受精后46 h 26 min，胚層完全包裹住卵黃，胚孔封閉，這個時期稱為胚孔封閉期(圖3Q)。

2.2.6 器官形成階段 受精后57 h 3 min，胚體中部位置出現(xiàn)約6對透明肌節(jié)，為肌節(jié)出現(xiàn)期(圖3R)。受精后64 h 1 min，頭部兩側出現(xiàn)橢圓形的凹陷并形成眼囊，此時肌節(jié)增至約10對，胚胎發(fā)育進入眼囊期(圖3S)。受精后70 h 41 min，卵黃一側開始凹陷，肌節(jié)增至約23對，為尾芽期(圖3T)。受精后74 h 30 min，眼杯口出現(xiàn)圓形的晶體，尾與胚體長軸成銳角，肌節(jié)約26對，為晶體出現(xiàn)期(圖3U)。受精后76 h 1 min進入肌肉效應期，胚體開始顫動，尾芽逐步增長，肌節(jié)約31對，此時為肌肉效應期(圖3V)。受精后77 h 56 min，肌節(jié)約35對，卵黃囊前方出現(xiàn)排列成串的細胞，形成心臟原基，即心臟原基期(圖3W)。受精后82 h 6 min，胚體兩側的耳囊中出現(xiàn)2個顆粒，肌節(jié)約37對，此時為耳石期(圖3X)。受精后86 h 23 min，尾部細胞聚集突出于體表，形成尾鰭原基，肌節(jié)約39對，為尾鰭原基期(圖3Y)。受精后104 h 1 min，肌節(jié)約42對，心臟開始搏動，胚胎發(fā)育進入心臟搏動期(圖3Z)。受精后123 h 51 min，耳囊后下方與卵黃交界處出現(xiàn)胸鰭原基，軀干出現(xiàn)血液循環(huán)，進入胸鰭原基形成期(圖3a)。

2.2.7 孵化出膜階段 受精后145 h 1 min進入出膜期(圖3b)，此階段胚體開始劇烈運動，尾部最先破膜而出，仔魚身體完全伸展。受精后147 h 31 min，完成出膜，出膜仔魚呈淡黃色，通體透明，全長為(8.72±0.26)mm，可以觀察到血液循環(huán)路線，卵黃囊緊貼仔魚腹部，仔魚靜臥魚水底，此時為初孵仔魚(4A)。

A—受精卵；B—胚盤期；C—2細胞期；D—4細胞期；E—8細胞期；F—16細胞期；G—32細胞期；H—64細胞期；I—多細胞期；J—囊胚早期；K—囊胚中期；L—囊胚后期；M—原腸早期；N—原腸中期；O—原腸后期；P—神經胚期；Q—胚孔封閉期；R—肌節(jié)出現(xiàn)期；S—眼囊期；T—尾芽期；U—晶體出現(xiàn)期；V—肌肉效應期；W—心臟原基期；X—耳石期；Y—尾鰭原基期；Z—心臟搏動期；a—胸鰭原基形成期；b—出膜期。

2.3 厚唇裂腹魚早期仔魚發(fā)育

早期仔魚發(fā)育分為眼球色素出現(xiàn)期、體色素出現(xiàn)期、鰾充氣期和卵黃囊完全吸收期4個時期(表2)。仔魚生長溫度控制在15.0～19.0 ℃，出膜后158 h后，仔魚開始攝取開口餌料豐年蟲。待到出膜后432 h后，仔魚卵黃囊消耗完全，依靠外源性營養(yǎng)存活時，投喂微粒子飼料。經過回歸分析，厚唇裂腹魚早期仔魚的全長生長方程為

表2 厚唇裂腹魚早期仔魚發(fā)育觀察

L=6×10-5t2+0.001 8t+9.417 6

(R2=0.992 2，n=70)。

其中：L為仔魚全長(mm)；t為出膜時間(h)。

出膜后200 h內，仔魚生長較緩慢，200 h后仔魚生長速度逐漸加快，在出膜后432 h時全長達到(21.51±0.75)mm(圖5)。當仔魚體色變?yōu)楹谏珪r，卵黃囊吸收50%以上，消化道貫通，即可下土池塘。

圖5 厚唇裂腹魚早期仔魚的生長

2.4 厚唇裂腹魚人工繁殖試驗

2019年4月27日—5月16日在新疆維吾爾自治區(qū)克孜勒蘇柯爾克自治州烏恰縣卡拉貝利水利樞紐工程魚類增殖放流站催產厚唇裂腹魚親魚35組，進行了9批次厚唇裂腹魚人工繁殖試驗,共獲得成熟卵粒20.69萬粒，平均催產率為77.71%，平均受精率為76.73%，平均孵化率為89.14%，獲水花魚苗14.12萬尾(表3)。

表3 厚唇裂腹魚人工繁殖試驗

3 討論

3.1 人工馴養(yǎng)與繁殖

親魚是人工繁殖的基礎，其培育的最終目的是獲取性腺成熟的個體[11]。本試驗中所用親魚捕自天然水體，野性較強，應激反應明顯。為避免因應激反應造成親魚拒絕攝食、體弱染病和四處亂撞等情況，需精心培育親魚，投喂鮮活餌料，保持長流水。經人工馴養(yǎng)后，厚唇裂腹魚性腺可發(fā)育成熟并正常進入繁殖期。人工催產的原理是通過注射外源激素來調節(jié)魚類自身的內分泌活動，促進內源性激素的釋放，從而誘導性腺發(fā)育成熟并排出精子和卵子[12]。本試驗中，選擇促黃體激素釋放激素LHRH-A3、馬來酸地歐酮DOM和人絨毛膜促性腺激素HCG 3種催產劑，采用2次注射法進行催產，這與對云南盤鮈Discogobioyunnanensis[13]、翹嘴鱖Sinipercachuasti[14]和泥鰍Misgurnusanguilicaudatus[15]的催產方法類似。

A—初孵仔魚；B、C—眼球色素出現(xiàn)期；D、E—體色素出現(xiàn)期；F、G—鰾充氣期；H—卵黃囊完全吸收期。

3.2 水溫對人工繁殖的影響

本試驗中，厚唇裂腹魚最佳催產水溫在18.5 ℃，催產率高達100%，在17.5～19.5 ℃水溫下，厚唇裂腹魚催產率均達到50%以上，這與其他裂腹魚亞科催產所需水溫相似，如青海湖裸鯉Gymnocypisprzewalskii[16]為16.0～20.0 ℃，塔里木裂腹魚Schizothoraxbiddulphi[11]為13.0～18.0 ℃，扁吻魚Aspiorhynchuslaticeps[17]為14.0～21.0 ℃。本試驗中，厚唇裂腹魚最佳孵化溫度為17.0～17.5 ℃，溫度較低。低溫可以延緩魚卵胚胎發(fā)育，減少能量消耗，有效抵御外界溫度強烈變化，從而提高胚胎成活率[18]。

3.3 孵化缸淋浴式孵化的優(yōu)點

劉鑒毅等[19]在改進中華鱘人工繁殖關鍵技術中，采用孵化缸淋浴式方法孵化受精卵，結果顯示，該方法可有效減少水霉的發(fā)生，同時孵化率高達96%。康鵬天等[20]通過孵化缸淋浴式孵化法、比平列槽微流水孵化法和孵化缸微流水孵化法3種用不同的孵化方式進行青海湖裸鯉受精卵孵化試驗，結果發(fā)現(xiàn)，孵化缸淋浴式孵化方式有利于將空氣中的氧氣帶入孵化水體，降低了水霉病的發(fā)病率；孵化缸淋浴式孵化方式可有效提高孵化率,與比平列槽微流水孵化法相比提高了15%,比孵化缸微流水孵化法提高了7%；孵化缸淋浴式孵化方式還可縮短26～42 h的孵化期，以及13 h的出苗高峰期時間差。裂腹魚亞科魚類人工繁殖過程中多數(shù)采用微水流孵化法，微流水孵化法結果顯示，花斑裸鯉Gymnocypriseckloni孵化率為72.2%[21]，齊口裂腹魚Schizothoraxprenanti孵化率最高為77.0%[22]，長絲裂腹魚Schizothoraxdolichonema平均孵化率為45.7%[23]。本試驗中采用孵化缸淋浴式孵化方式，平均孵化率高達89.14%，遠高于其他裂腹魚亞科魚類的孵化率。筆者推測，孵化缸淋浴式孵化法可有效提高孵化率，值得在裂腹魚類人工繁殖中推廣。

3.4 厚唇裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的胚胎發(fā)育差異

將厚唇裂腹魚與短須裂腹魚Schizothoraxwangchiachii[24]、拉薩裂腹魚Schizothoraxwaltoni[25]、光唇裂腹魚Schizothoraxlissolabiatus[26]、齊口裂腹魚[27]、新疆裸重唇魚Gymnodiptychusdybowskii[28]、祁連山裸鯉Cymnocyprischilianensis[29]、扁吻魚[30]、硬刺松潘裸鯉Gymnocyprispotaninifirmispinatus[31]等其他裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育進行比較，結果如表4所示。裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育溫度均較低(不超過22 ℃)，這與裂腹魚類生活在高原地區(qū)的寒冷水體環(huán)境相適應。厚唇裂腹魚胚胎發(fā)育用時長于齊口裂腹魚、新疆裸重唇魚、扁吻魚，短于短須裂腹魚、拉薩裂腹魚、光唇裂腹魚、祁連山裸鯉魚、硬刺松潘裸鯉，這可能是孵化水溫和魚的種類差異造成的。厚唇裂腹魚的受精卵卵徑在幾種裂腹魚亞科魚類屬于較大類型，卵徑較大的魚類可能發(fā)育速率較慢[32]，但是較大卵黃可為仔魚提供更多營養(yǎng)物質，彌補了厚唇裂腹魚孵化時間長帶來的存活壓力[33-34]，延長了仔魚從內源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)轉變的時間，從而提高了仔魚的成活率[35]。出膜階段時，厚唇裂腹魚、短須裂腹魚、拉薩裂腹魚、硬刺松潘裸鯉為胸鰭原基形成期，光唇裂腹魚、齊口裂腹魚、新疆裸重唇魚、祁連山裸鯉為心臟搏動期，而扁吻魚為血液循環(huán)期。在胚胎發(fā)育過程中，厚唇裂腹魚心臟及血液循環(huán)、尾鰭原基和胸鰭原基均在孵化出膜前形成，這有利于仔魚更好地適應高原貧營養(yǎng)及低水溫環(huán)境[36]，而厚唇裂腹魚、短須裂腹魚、新疆裸重唇魚和祁連山裸鯉均為尾部先出膜，拉薩裂腹魚、光唇裂腹魚、齊口裂腹魚、扁吻魚和硬刺松潘裸鯉的出膜方式均為頭部或尾部出膜，出膜方式的不同可能與魚的種類差異有關。

表4 厚唇裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育特點比較

3.5 厚唇裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的仔魚發(fā)育差異

厚唇裂腹魚初孵仔魚全長大于祁連山裸鯉、扁吻魚和硬刺松潘裸鯉，短于短須裂腹魚、齊口裂腹魚和新疆裸重唇魚，與光唇裂腹魚相近(表4)，推測厚唇裂腹魚初孵仔魚在裂腹魚亞科中屬于中等類型。厚唇裂腹魚仔魚出膜18 d后卵黃囊才消耗殆盡，時間遠長于光唇裂腹魚、新疆裸重唇魚、祁連山裸鯉、扁吻魚和硬刺松潘裸鯉(表4)。推測厚唇裂腹魚仔魚為了更好地適應餌料生物匱乏的低溫環(huán)境，所以發(fā)育過程中需要更多的內源性營養(yǎng)物質，以降低仔魚在短時間內攝食不到外源營養(yǎng)而死亡的風險，從而提高仔魚的成活率[37]，但關于厚唇裂腹魚卵黃囊確切機制還有待進一步研究。本試驗顯示，厚唇裂腹魚仔魚孵化后158 h后，進入混合營養(yǎng)期，此時卵黃囊并未完全吸收，仔魚生長緩慢，孵化后200 h，卵黃囊被大量吸收，呈細條狀，仔魚攝取外源性營養(yǎng)的能力增強，生長速度加快[38-39]。

3.6 厚唇裂腹魚早期發(fā)育與環(huán)境適應性

克孜勒河位于中國最西部，平均海拔4 000 m以上，年平均降水量150 mm左右，晝夜溫差大，年平均氣溫較低，流域內大部分地區(qū)為荒山戈壁，生態(tài)環(huán)境惡劣[40]。本試驗顯示，厚唇裂腹魚胚胎孵化溫度較低，發(fā)育過程中器官發(fā)育較快，心臟及血液循環(huán)、尾鰭原基和胸鰭原基在出膜前就已形成，使出膜后仔魚能更好地適應貧營養(yǎng)型水體。出膜仔魚卵黃囊存在時間較長，從而降低了仔魚因攝取不到外源營養(yǎng)而死亡的風險，因此，厚唇裂腹魚胚胎和早期仔魚發(fā)育過程與其生境具有一定的適應性。