尼羅羅非魚CD209基因的克隆、表達及功能鑒定

羅國玲 ，王孝謙 ，簡紀常 ，魯義善 ，湯菊芬 ，黃瑜*

(1.廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088； 3.水產經濟動物病害控制廣東省普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088)

先天免疫是免疫防御機制的第一道防線，在脊椎動物和無脊椎動物中對外來病原體具有重要的防御功能。在低等脊椎動物硬骨魚中，先天免疫系統在保護生物體免受病原體入侵方面發揮著關鍵作用[1]。機體通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別細菌、真菌和病毒等病原體，使自身免受病原體侵害[2]，其中，Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、RIG-Ⅰ樣受體(RIG-I like receptors，RLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)在識別病原體相關分子模式的先天免疫中起著重要的作用[3]。

CD209又稱為樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子3結合的非整合素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)，是模式識別受體C型凝集素家族的成員,其既能激活初始免疫反應，又能抑制免疫反應，具有正負免疫調節作用，近年來該研究較受關注[4-6]。研究者最初研究樹突狀細胞(dendritic cell，DC)在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染過程中的作用時發現，CD209是樹突狀細胞膜上的一種C型凝集素，可以和T細胞表面的細胞間黏附分子3(ICAM-3)相互作用，介導DC細胞與T細胞的原始黏附，后來研究發現，CD209可在DC黏附遷移及炎癥反應、激活初始T細胞并啟動免疫應答及病原體與腫瘤逃逸等諸多方面發揮著重要作用[7-9]。CD209主要在DC和巨噬細胞的表面表達，可參與細胞相互作用的調節和模式識別[10]。目前，關于CD209的研究主要集中在人和小鼠，而對于魚類的CD209和DCs的研究報道較少。研究表明，斑馬魚在受到釘形貝血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或嗜水氣單胞菌刺激后，通過干擾CD209的表達可以顯著抑制T細胞活化、抗體(IgM)的產生和細菌免疫保護，這表明CD209在適應性免疫的啟動和發展中發揮至關重要的作用[11]。此外，在病原感染后，半滑舌鰨腎臟和血液中的CD209表達顯著上調，且CD209蛋白能顯著促進半滑舌鰨白細胞對細菌的吞噬作用[12]，這表明CD209在病原體感染過程中發揮著重要作用。

尼羅羅非魚Oreochromisniloticus為中國重要的經濟魚類之一。近年來,隨著養殖規模的不斷擴大,高密度養殖和水體污染等原因導致羅非魚疾病大規模暴發,給水產養殖業造成了巨大的經濟損失[13]。尤其是近年來新發現的羅非魚湖病毒，已對厄瓜多爾等國家的羅非魚養殖造成了巨大損失，因此，有關羅非魚先天免疫防御系統的研究可為病害的控制提供幫助。目前，關于CD209在尼羅羅非魚中的作用未見報道，其在尼羅羅非魚疾病的發生、發展中的作用機理尚不清楚，為此，本研究中對尼羅羅非魚CD209基因(OnCD209)進行了克隆及序列分析，檢測了CD209在各組織中的表達情況及無乳鏈球菌感染后的表達模式，并分析了CD209在細胞中的定位情況及其在細胞中過表達時對NK-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell)通路的影響，以期為進一步研究羅非魚CD209的生物學功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用健康尼羅羅非魚(體質量為100 g±5 g)購自廣東省湛江市湖光鎮的某漁場。無乳鏈球菌是廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室從患病尼羅羅非魚體內分離保存的菌株(ZQ1901)。

實驗室常規基因克隆相關試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司，RNA提取、cDNA合成及熒光定量相關試劑購自北京全式金生物公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自碧云天生物公司，引物合成和測序均由廣州生工生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計及飼養管理 試驗開始前，將尼羅羅非魚于實驗室條件下暫養2周，暫養于1 000 L的充氧水箱，每個水箱養殖200尾尼羅羅非魚，水溫控制在28 ℃左右，每日早晚各投喂一次飼料(恒興羅非魚膨化飼料106)，每3日換一次水，每次排掉1/2養殖水后再注入新水，并利用虹吸法清理缸內排泄物。試驗開始前，隨機抽檢一些尼羅羅非魚的脾臟、頭腎、肝臟等組織，驗證是否含有病原微生物。對魚體解剖取其組織前使用丁香酚麻醉處理，所有的處理均符合廣東省試驗動物福利相關規定。

1.2.2 尼羅羅非魚總RNA的提取及CD209開放閱讀框的克隆 采用TRIZOLUP方法提取尼羅羅非魚脾臟總RNA，將脾臟組織置于2 mL的無RNA酶EP管中，加入1 mL的TRIZOLUP及鋼珠一個，使用研磨器研磨3 min；將200 μL氯仿加入組織勻漿中，充分震蕩，混合液于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將分層后的上層水相轉移至1.5 mL無RNA酶的EP管中；加入等體積提前預冷的異丙醇，室溫靜置10 min；離心后棄上清液，加入500 μL體積分數75%的乙醇，溫和震蕩后以8 000 r/min離心5 min，棄上清液，室溫下晾干10 min，然后加入無RNA酶的水溶解RNA樣品，使用超微量生物檢測儀檢測其濃度，并用瓊脂凝膠電泳檢測提取的RNA質量。使用全式金公司的反轉錄試劑盒進行第一鏈cDNA的合成，產物于-20 ℃下保存待用。

使用Prime 5.0設計一對引物(CD209-F: ATGAGTGTCGAGTACCATGCATCC,CD209-R: CTACATCTCACAGATCCAGTTTTGTTC)，以脾臟的第一鏈cDNA為模板，進行CD209開放閱讀框(Open reading frame，ORF)片段的克隆。PCR反應體系(共20 μL)：Ex Taq 酶10 μL，cDNA模板1 μL，CD209-F/R各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃下循環變性30 s，60 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸50 s，共進行35個循環；最后再在72 ℃下延伸5 min。通過瓊脂凝膠電泳檢測PCR產物條帶大小與理論值是否相符，然后對PCR產物進行純化，將純化后的PCR產物轉入pMD-18T克隆載體，涂板挑菌后進行菌落PCR檢測，挑取陽性克隆送至廣州生工生物有限公司進行測序。

1.2.3OnCD209序列分析 測序結果采用DNAMAN進行拼接，用美國生物技術信息中心(NCBI)Blast在線程序進行序列比對。用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析OnCD209潛在的開放閱讀框架。利用在線軟件ExPASy-ProtParam工具(https://web.expasy. org/protparam/)對氨基酸序列、分子量和理論pI進行預測。使用在線程序ExPASY (http://ca.expasy.org)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)獲得氨基酸序列和結構域信息,在NCBI的資源庫中對多個物種的CD209蛋白進行選擇,然后采用ClustalX 2.0、GeneDoc和DNAMAN進行多重序列比對分析，采用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.4OnCD209基因的組織表達 從實驗室暫養的健康尼羅羅非魚中隨機抽取5尾，于無菌條件下進行解剖，分別取肝臟、脾臟、頭腎、鰓、腸道、胸腺、皮膚、肌肉、血液和腦10個組織，分別放入無RNA酶的2 mL EP管中進行組織研磨后，提取RNA并反轉錄成cDNA，方法同“1.2.2節”。采用RT-qPCR法檢測10個組織CD209基因的表達情況，設計一對熒光定量引物(qCD209-F: TGTTTACTCCTCTTGGCTGGTG，qCD209-R: AGCT- TATCTGCGTATCCCGTTT)。PCR反應體系(共10 μL)：Mix 5.0 μL，ddH2O 3.5 μL，cDNA模板 0.5 μL，qCD209-F/R各0.5 μL。反應程序為：95 ℃下預變性30 s；95 ℃下循環變性15 s，60 ℃下退火復性15 s，72 ℃下延伸20 s，共進行30個循環。對每份樣品的CD209和β-actin表達量進行檢測，每個樣品設置3個重復，采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量[14]。

1.2.5 無乳鏈球菌刺激后OnCD209基因的組織表達 采用RT-qPCR法(使用羅氏Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀)檢測注射無乳鏈球菌后OnCD209基因的表達量。病原刺激如下：將-80 ℃下保存的無乳鏈球菌解凍后取出1.5 mL接種于100 mL的BHI培養基中，于37 ℃條件下培養至OD600 nm為1.0后，收集于離心管內，用PBS懸浮細菌濃度至1×107CFU/mL，而后吸取100 μL菌液對尼羅羅非魚進行腹腔注射。在注射后0、6、12、24、48、72、96 h采集組織樣本，并進行RNA提取和cDNA合成，方法同“1.2.2節”。然后以合成的cDNA為模板，分別對所提取的組織樣品進行RT-qPCR檢測，反應體系和反應程序同“1.2.4節”。對每份樣品CD209和β-actin表達量進行檢測，每個樣品設置3個重復。

1.2.6OnCD209在293T細胞中的亞細胞定位 設計一對引物(CD209-pEGFP-N1-F:CCGGAATTCTATGAGTGTCGAGTACCATG，CD209-pEGFP-N1-R:CGGGGTACCCTACATCTCACAGATCCAG)，以尼羅羅非魚的脾臟cDNA為模板進行基因克隆，PCR產物純化后，使用相同的限制性快切酶對PCR產物及pEGFP-N1進行雙酶切處理，酶切產物純化后使用T4連接酶進行產物與載體連接，然后轉入DH5α感受態細胞中，涂板挑菌，將陽性菌落送至廣州生工生物有限公司進行測序，測序正確的菌液進行去內毒素質粒提取。

將293T細胞接種于12孔細胞培養板內，當細胞增殖至密度為80%～90%時，根據Lip3 000使用說明書，將構建好的CD209-pEGFP-N1或pEGFP-N1表達載體轉染至細胞內。將酒精浸潤的圓形蓋玻片于火上烤至干燥后放入12孔板內，使用胰酶對轉染24 h的細胞進行消化處理后，加入培養基混合物(10%的胎牛血清、1%的青霉素鏈霉素混合液及M199培養基)懸浮細胞并轉入含蓋玻片的細胞培養板內，試驗設3個重復。培養5 h后，使用體積分數4%的多聚甲醛固定細胞，30 min后吸取固定液并加入PBS洗滌，取出蓋玻片反蓋于滴有1～2滴含DAPI封片劑的載玻片上。封片完畢后于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 雙熒光素酶活性分析 設計一對引物(CD209-pcDNA3.1-F：CCGGAATTCGCCACCATGAGTGTCGAGTACCATG,CD209-pcDNA3.1-R：CCCAAGCTTCATCTCACAGATCCAG)，構建OnCD209-pcDNA3.1過表達載體，方法同“1.2.6節”。將293T細胞接種于12孔板內，按照Lip3000使用說明書將啟動子報告質粒(200 ng)、內參質粒PRL-TK(4 ng)及CD209-pcDNA 3.1或pcDNA 3.1質粒(250 ng)共轉染至細胞內，24 h后收取細胞培養物，試驗設3個重復。使用碧云天生物公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性。

1.3 數據處理

試驗數據均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0軟件進行最小顯著性差異(LSD)檢驗，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 OnCD209基因的克隆及其推導的氨基酸序列

利用聚合酶鏈式反應擴增了尼羅羅非魚CD209基因的ORF區(圖1)，命名為OnCD209(GenBank登錄號:XP_003448039.1)。OnCD209基因的ORF區片段長度為1 383 bp，編碼460個氨基酸，預測蛋白相對分子質量為53 270，理論等電點為5.04。用SMART保守結構域在線軟件預測該蛋白為一個跨膜蛋白，該蛋白存在一個C型凝集素結構域(C-type lectin domain，CTLD)(圖2)。用SignalP 4.1預測該蛋白的氨基酸序列第1～29位為CD209的信號肽區。用TMHMM 2.0預測該蛋白在N端1～42氨基酸殘基之間對應一個胞內區，在43～65氨基酸殘基之間為一個跨膜區，在66～460氨基酸殘基之間對應一個胞外區(圖1)。用PSITE預測該蛋白存在8個糖基化位點，1個糖胺聚糖附著位點，2個cAMP和cgmp依賴的蛋白激酶磷酸化位點，8個磷酸化位點，11個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位點，5個?；稽c，1個Prenyl基團結合位點(CAAX box)，6個微體C端定位信號，1個C型凝集素域信號和9個亮氨酸拉鏈模式。

加粗部分為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG);加下劃線部分為C型凝集素結構域。

圖2 尼羅羅非魚CD209保守結構域預測

2.2 OnCD209氨基酸同源性比較及系統進化分析

OnCD209氨基酸序列與其他已知脊椎動物的CD209、CD209-like及C型凝集素的多重比對顯示，其均具有一個C型凝集素保守結構域，經BlastX比對顯示，尼羅羅非魚CD209與斑馬魚DaniorerioC型凝集素家族4成員M(C-type lectin domain family 4 member M)的氨基酸序列一致性最高(90.34%)，與高等脊椎動物人、獼猴、牛、豬的CD209一致性較低(14.86%～20.04%)(圖3)。進化樹分析顯示，尼羅羅非魚CD209氨基酸序列與田紋獅子魚LiparistanakaeCD209聚為一大支，親緣關系最近,且魚類的CD209聚為一支，高等哺乳動物的CD209聚為另一支(圖4)。

方框示C型凝集素保守結構域。

圖4 尼羅羅非魚CD209氨基酸序列聚類分析

2.3 OnCD209基因的組織表達

使用實時熒光定量PCR法檢測了健康尼羅羅非魚組織中的CD209基因表達情況。從圖5可見：OnCD209 mRNA在所有組織中均被檢測到，其中，在腦中微量表達，在血液、皮膚和肌肉中高表達，在頭腎和腸道中較高表達，而在鰓、肝臟、脾臟和胸腺中的表達水平相似，血液、皮膚、肌肉、頭腎、腸道、鰓、肝臟、脾臟和胸腺中CD209基因的表達量分別為腦中的8.57、8.37、8.04、4.18、3.58、2.38、2.27、1.59、1.42倍。

*表示與腦組織的表達量相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 無乳鏈球菌刺激后OnCD209基因的組織表達

為了分析細菌感染對CD209基因表達的影響，用無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚，檢測了被感染6、12、24、48、72、96 h后尼羅羅非魚肝臟、脾臟、頭腎和腸道中CD209基因的表達情況。結果顯示，羅非魚肝臟和頭腎中CD209的表達量均在6、72、96 h時顯著上調(P<0.05)，脾臟中的表達量在6 h和72 h時顯著上調(P<0.05)，腸道中的表達量在6、48、72 h時顯著上調(P<0.05)，在肝臟、頭腎、脾臟和腸道中的最高表達量分別為對照組的1.26、2.43、1.33和5.83倍(圖6)。

*表示與0 h的表達量相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 OnCD209基因的亞細胞定位分析

將構建的綠色熒光標簽載體OnCD209-pEGFP-N1與空載pEGFP-N1分別轉染入293T細胞，經DAPI染色后結果如圖7所示，pEGFP-N1均勻地分布于整個細胞內，而OnCD209-pEGFP-N1主要分布于胞膜上，與預測結果相符合。

A1和B1分別為OnCD209-pEGFP-N1、pEGFP-N1細胞核DAPI染色；A2和B2分別為OnCD209-pEGFP-N1、pEGFP-N1的綠色熒光蛋白；A3和B3為細胞核與綠色熒光蛋白疊加。

2.6 過表達OnCD209基因對NF-κB活性的影響

使用細胞轉染和雙熒光素酶報告基因檢測系統研究了OnCD209在信號轉導中的作用，結果顯示，在293T細胞中過表達OnCD209基因能增強NF-κB通路的活性(圖8)。

*表示組間有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

3.1 OnCD209分子結構分析

CD209(DC-SIGN)是C型凝集素受體家族的重要成員之一，是先天免疫中識別和清除病原體的關鍵分子[15]，在人類中，CD209主要在促炎性細胞因子的巨噬細胞群上表達，在激活炎癥免疫反應中發揮重要的作用[16-17]。CD209在人類、靈長動物及小鼠中的同源物已被鑒定出來，然而在魚類的研究中了解較少。為了深入了解魚類CD209基因，本研究中首次獲得了尼羅羅非魚CD209的開放閱讀框序列，其片段長度為1 383 bp，可編碼461個氨基酸，預測OnCD209是一個含有胞漿外區、跨膜區和胞內區的跨膜蛋白，在其胞漿外區含有一個C型凝集素特有的CTLD。氨基酸多重序列比對結果表明，尼羅羅非魚CD209氨基酸序列與半滑舌鰨、人和小鼠的CD209亞型具有中等一致性，為33%～35%[18]。然而，本研究中尼羅羅非魚CD209氨基酸序列與人、獼猴等高等哺乳動物的CD209氨基酸序列一致性不高，僅為14.86%～20.04%，這表明CD209在高等與低等脊椎動物間功能比較分化，相對不保守。系統進化分析表明，CD209氨基酸序列在高低等脊椎動物進化上聯系密切，尼羅羅非魚CD209與田紋獅子魚聚為一支，而與斑馬魚等同為低等脊椎動物的物種聚為不同分支，這表明CD209在進化上也相對不保守。

3.2 OnCD209基因的組織表達分析

本研究表明，OnCD209基因在所有受檢的組織中均有分布，在血液、皮膚和肌肉中表達量較高，其次是頭腎、腸道，在腦中表達量最低。血液內的血循環是復雜的固有免疫和適應性免疫反應的交匯場所，而固有免疫反應是機體防御致病原入侵血循環的第一道防線，但血液固有免疫反應必須得到精確適當的調控才能消滅病原菌[19-20]，同CD209基因在半滑舌鰨中的表達模式相似[12]，CD209基因在尼羅羅非魚的腦組織中有表達，推測CD209參與了血液固有免疫反應的調節。而眾所周知，皮膚是魚類黏膜免疫系統的第一道屏障，極易感染[21]，且OnCD209基因在肌肉組織中也大量表達，表明其在免疫和非免疫組織中均有潛在的作用。

3.3 無乳鏈球菌感染后OnCD209基因的表達變化

本研究表明，無乳鏈球菌侵染后,CD209在尼羅羅非魚肝臟、脾臟、頭腎和腸道中的表達模式具有相似的變化趨勢，均在6 h時表達量明顯上調，在12 h和24 h時表達量明顯下調，之后在48 h時表明量再次上調，其中，表達量顯著性下調可能是無乳鏈球菌感染12 h和24 h時造成了尼羅羅非魚機體紊亂，使CD209表達受到抑制。肝臟具有非特異性吞噬的免疫功能[22]，且CD209主要表達于巨噬細胞表面，本研究中尼羅羅非魚肝臟中CD209表達量在感染后顯著上調，可能是CD209參與了巨噬細胞的吞噬作用；無乳鏈球菌感染后，在尼羅羅非魚脾臟和頭腎中也能觀察到CD209表達量顯著上調，這可能是因為脾臟和頭腎是魚類的兩個主要造血器官，也是無乳鏈球菌攻擊的主要靶器官[23]；腸道是屬于黏膜免疫系統的組成之一，是執行局部特異性免疫功能的主要場所[24]，OnCD209在腸道中顯著上調，表明其在魚體抵御病原體的入侵過程中發揮重要作用。以上結果表明，OnCD209可能參與了魚體抗細菌感染的免疫途徑。

3.4 OnCD209基因的亞細胞定位分析

研究表明，哺乳動物的CD209是一種特異表達于樹突狀細胞和巨噬細胞表面的跨膜蛋白[25-26]，主要于細胞膜表面表達。本研究中將OnCD209-pEGFP-N1重組質粒轉染293T細胞，發現其主要定位于細胞膜中，這與前人的研究結果相同，表明同哺乳動物的CD209相同，尼羅羅非魚的CD209也在細胞膜中發揮其免疫調控作用。

3.5 OnCD209基因對NF-κB信號通路的影響

NF-κB是一種蛋白復合物，參與調控DNA的轉錄、細胞因子的產生及細胞的存活[27]。NF-κB信號通路在免疫和炎癥中起到重要作用，能夠通過細胞因子、黏附因子、酶、受體等多個方式參與炎癥反應[28-29]。樹突狀細胞上表達的不同的模式識別受體，能識別入侵的病原體，導致細胞內信號傳導過程的激活，從而激活適應性免疫。已有研究表明，CD209(DC-SIGN)與不同甘露糖表達的病原體，如結核分枝桿菌和HIV-1相互作用，被CD209識別后，會觸發Raf-1依賴的信號通路，調節TLR誘導的NF-κB信號的激活[30]。本研究中，通過轉染OnCD209真核表達質粒至293T細胞內，并采用雙熒光素酶報告系統檢測了尼羅羅非魚CD209對NF-κB信號通路的影響，結果表明，293T細胞內過表達時OnCD209基因對NF-κB通路活性有顯著上調作用，這與前人研究結果相符。

4 結論

1)本研究中成功克隆了尼羅羅非魚CD209基因的ORF序列，預測CD209蛋白具有一個保守的C型凝集素結構域，且在不同物種間相對不保守。

2)在健康尼羅羅非魚的各個組織中均能檢測到OnCD209 mRNA，其中，血液中CD209 mRNA表達量最高。

3)OnCD209在無乳鏈球菌感染后的體內表達呈現先上調后下調再上調的表達模式，表明OnCD209可能參與了抗細菌感染的免疫途徑。

4)OnCD209定位于細胞膜，且在293T細胞中過表達時能顯著增強NF-κB的活性。