GRIN2A、GRIN2B基因多態性與注意缺陷多動障礙的關聯研究

丁凱景 丁雨欽 周圓月 劉艷 簡鳳清 廖文靜 童海靜 孫玉燕 李艷萍 周國嶺

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）是一種神經發育障礙，我國兒童青少年的患病率為6.26%[1]。ADHD的核心癥狀為注意力不集中、多動和（或）沖動[2]，對患者教育、工作、生活等多項個人發展問題影響深遠，給家庭、社會造成負擔，是一個重要的公共衛生問題。ADHD的病因和發病機制至今尚未完全明了，許多研究提示ADHD有家族聚集性，大量的家系、寄養子、雙生子及新近分子水平的研究均提示遺傳因素是ADHD的發病機制之一[3-4]。但目前尚未發現與這種疾病直接相關的特異性基因，具體的遺傳模式也尚未闡明。谷氨酸是哺乳動物中樞神經系統中含量最豐富的一種氨基酸類興奮性神經遞質，參與神經系統多種重要功能的調節[5]。N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR）是離子型谷氨酸受體的一個亞型，不僅在神經系統發育過程中發揮重要的生理作用，而且對神經元回路的形成亦起著關鍵的作用，研究表明NMDAR是學習和記憶過程中一類至關重要的受體[6]。本研究選取了NMDAR亞基NMDA2A基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A，GRIN2A）和NMDA2B基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B，GRIN2B）的2個單核苷酸多態位點（single nucleotide polymorphisms，SNPs）進行研究，探討其基因多態性與ADHD之間的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016年2月至2018年4月就診于浙江大學醫學院附屬精神衛生中心（杭州市第七人民醫院）兒童心理科ADHD患兒49例（ADHD組），其中男36 例、女 13 例，年齡 6～15（8.55±2.88）歲，ADHD 由 2 名主治級別以上的精神科醫師按照美國精神疾病診斷統計手冊第五版（the diagnostic and statistical manual of mental disorders fifth edition，DSM-5）為診斷標準共同確診。選擇同時期我院健康體檢兒童50例作為健康對照組，其中男 30 例，女 20 例，年齡 6～15（8.80±2.49）歲。排除標準：（1）智商＜70分；（2）自閉癥譜系障礙、抽動穢語綜合征及其他神經發育障礙；（3）目前或既往符合精神分裂癥、情緒障礙及其他精神心理疾?。唬?）癲癇及其他重大軀體疾病。兩組對象性別、年齡比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究均征得患兒本人知情同意，并由監護人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 ADHD癥狀評定及神經心理測評 采用以下ADHD癥狀評定量表和神經心理測評，對患兒進行認知功能、行為表現、注意力水平的系統評價。（1）兒童注意力量表（Swanson，Nolan，and Pelham version Ⅳ scale，SNAP-Ⅳ）：采用26條目量表，內容包含注意缺陷分量表（第1～9題）、多動沖動分量表（第 10～18題）、對立違抗分量表（第19～26題），由患兒父母填寫，用以評估ADHD患者的嚴重程度并進行亞型分類[7]。（2）中國韋氏兒童智力量表（Chinese Wechsler intelligence scale for children，C-WISC）：由心理測量技師實施，用以評價兒童智力水平。（3）Conners父母評癥狀量表（conners parent symptom questionnaire，PSQ）：采用 48 條目量表，包含沖動多動、品行問題、多動指數、學習問題、心身障礙和焦慮6個因子，由患兒父母填寫，篩查兒童行為問題。（4）注意力競量測驗（the test of variables of attention，T.O.V.A.）：其為一種持續性操作測驗，包含理解力商數、控制力商數、注意力商數、多動商數值等指標，用以評價ADHD患兒的操作水平。

1.2.2 基因檢測 兩組對象均抽取外周靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管-20℃冰箱保存，抽提樣本DNA（北京天根生化科技有限公司，血液基因組DNA提取試劑盒），采用紫外分光光度法進行DNA濃純度測定后保存于-80℃冰箱備用。根據美國國立生物信息情報中心檢索dbSNP數據庫（datebase of single nuleotide polymorphisms，dbSNP）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）以及既往文獻[8-9]，選取GRIN2A rs2229193和GRIN2B rs2284411作為候選基因位點，設計擴增引物（GRIN2B基因：5′-ACGTTGGATGATGACATCATCAGTGTCTGC-3′and 5′-ACGTTGGATGCATGACTTTTTTCCCCTACTC-3，GRIN2A基因：5′-ACGTTGGATGTTGACGAACTTCCGACATGG-3′and 5′-ACGTTGGATGCGTCATCGTGGAAGACA TAG-3′）。使用SNP基因分型試劑盒（美國，Applied Biosystems公司，40×TaqManSNP Genotyping Assay Mix）及萬能 PCR液（大連寶生物工程有限公司，Premix Ex TaqTM），在ABI 7300實時熒光定量 PCR儀（美國，Applied Biosystems公司）上進行實驗操作，PCR循環參數：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s、40個循環。擴增反應完成后，讀取反應后的熒光數據，利用內置軟件進行等位基因分型。采用PCR凝膠電泳檢測擴增產物，并隨機選取兩個樣本測序驗證多態性與實驗室數據一致性。

1.2.3 觀察指標 比較兩組GRIN2A基因型頻率G/G和G/A，GRIN2B基因型頻率C/C和（T/C+T/T）的分布差異。結合ADHD癥狀評定量表和神經心理測評得分，比較GRIN2A、GRIN2B不同基因型ADHD患兒的癥狀。

1.3 統計學處理 結合臨床數據、實驗室數據進行統計分析。采用SPSS 24.0統計軟件，所有數據經Epidata 3.0軟件二次錄入并核對。采用Haploview軟件進行候選基因多態位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗和連鎖不平衡分析。符合正態分布的計量資料以表示，比較采用t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果 兩組各SNPs基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規律（P＞0.05）。樣本有群體代表性，基因頻率能代表群體的基因分布。

2.2 兩組兒童GRIN2A、GRIN2B基因型頻率比較 見表 1、2。

表1 兩組兒童GRIN2A基因型頻率比較

由表1可見，兩組兒童GRIN2A基因型頻率（G/G比較G/A）分布比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

由表2可見，兩組兒童GRIN2B基因型頻率C/C和（T/C+T/T）分布比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表2 兩組兒童GRIN2B基因型頻率比較

2.3 GRIN2A、GRIN2B兩種不同基因型ADHD患兒的癥狀比較 見表3、4。

由表3、4可見，GRIN2A為G/A+A/A基因型的患兒較G/G基因型的患兒有更高的SNAP-Ⅳ對立違抗分量表得分，以及更高的PSQ品行問題得分，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩種基因型患兒在SNAP-Ⅳ其他分量表分、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。GRIN2B為C/C基因型和T/C+T/T基因型的兩種患兒 SNAP-IV、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表3 GRIN2A兩種不同基因型ADHD患兒的癥狀比較（分）

表4 GRIN2B兩種不同基因型ADHD患兒的癥狀比較（分）

3 討論

谷氨酸參與調節神經元的存活，調節神經元的樹突、軸突結構發育及參與突觸可塑性的形成等[6]。Spencer等[10]在對50個應用磁共振光譜學技術的薈萃分析中發現，ADHD患兒顱內尤其前扣帶皮層中谷氨酸代謝增加。在ADHD大鼠模型中，研究者也發現，前額葉紋狀體腦組織中發生谷氨酸代謝水平紊亂[11]。Park等[12]還發現谷氨酸代謝型受體亞型7（mGluR7）基因（GRM7）rs37952452的G/A基因型相較G/G基因型在哌醋甲酯治療中有更明顯的反應速度，可能在兒童多動癥治療響應哌甲酯發揮作用。谷氨酸受體基因在精神疾病中起著重要作用，并且可能與ADHD的癥狀表現或藥物響應相關[13]。

Dorval等[14]對GRIN2B的9個SNPs位點進行檢驗，發現其中3處單核苷酸多態性（其中以rs2284411尤為顯著）顯示了顯著的傳遞不平衡，且與ADHD的注意力缺陷、沖動多動癥狀均有關聯，但與認知水平、口頭的短時記憶或言語工作記憶無關。Turic等[15]發現GRIN2A的5號外顯子遺傳變異與ADHD的發病風險增加相關；然而Adams等[5]卻并未發現GRIN2A與ADHD沖動控制、認知表型的顯著關聯；同樣，Nyman等[16]也并未發現GRIN2A多態性與ADHD的陽性結果。高雪屏等[17]應用基因掃描技術發現GRIN2A的G1430A位點多態性與ADHD可能并無關聯。Kim等[9]發現ADHD患者GRIN2B等位基因與響應時間變異性存在關聯，C/C亞組的響應時間變異性高于C/T+T/T亞組；GRIN2A等位基因的G/G亞組比G/A+A/A亞組在測驗中存在更多的遺漏錯誤。該課題組的另一項研究還發現GRIN2B基因rs2284411位點C/C基因型顯示出對哌醋甲酯更好的治療反應，GRIN2B基因C/C基因型在CPT的RTV上也顯示出更大的改善，GRIN2A基因G/G基因型比G/A基因型顯示出更大的CPT錯分誤差改善[8]。同時，kim等[18]團隊的頭顱MRI成像研究也發現GRIN2B等位基因與左側上頂葉簇的靜態區域同質性均值有顯著的診斷和交互作用，且靜態區域同質性均值與具有T等位基因亞組的多動癥兒童顏色痕跡測試干擾評分呈正相關。而最近Zhang等[19]的研究則未發現GRIN2A、GRIN2B基因多態性與中國漢族人群ADHD易感性顯著相關。

本研究發現GRIN2A基因中A等位基因攜帶患兒有更多的對立違抗行為和品行問題，提示GRIN2A基因多態性可能與ADHD共病對立違抗障礙及品行障礙相關。與既往相關研究結果的不一致性可能與不同種族人群之間等位基因差異有關。本研究樣本量較少，且ADHD是多基因遺傳的復雜疾病，存在多種基因交互作用，本研究局限于兩個候選基因位點，該結論需進一步擴大樣本量，并行更多的谷氨酸能相關基因研究驗證。