帕金森病患者腸道菌群變化與臨床特征的相關性研究

童巧文 陳楊芳 吳森翔 鄭麗芬 陳依依 馮梅 葉華

帕金森病是一種中老年人常見的中樞神經系統退行性疾病。帕金森病的病理特征是黑質致密部中多巴胺能神經元明顯減少和路易小體形成。帕金森病臨床上主要表現為肌強直、運動遲緩和震顫等運動癥狀，以及睡眠障礙、感覺障礙、自主神經功能紊亂及神經精神障礙等非運動癥狀[1]。患者出現上述癥狀說明體內的自主神經系統和腸神經系統相關的腦-腸軸通路可能已受到影響[2-6]。中樞神經系統和胃腸道之間存在著腦-腸軸的雙向通信交流，而且越來越多的研究開始關注腸道菌群對腦-腸軸的作用[7-10]。帕金森病患者體內腦-腸-菌群軸的失調可能導致其胃腸道功能障礙[11]，并促進了帕金森病的發病，這支持了Braak等[2，4]關于帕金森病病理過程是從腸道影響到大腦的假設。本研究采用高通量測序技術對帕金森病患者腸道菌群進行定量檢測，分析菌群變化及與臨床特征的相關性，為帕金森病的發病機制提供理論支持，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2017年11月至2019年2月溫州市人民醫院神經內科診治的帕金森病患者30例為PD組，并選擇同期醫院體檢中心的健康體檢者30例為HC 組。PD 組男 14例，女 16例，年齡 46～79（66.1±7.2）歲，BMI為（22.85±2.71）kg/m2；HC 組男 18 例，女 12例，年齡 50～75（64.8±5.0）歲，BMI為（23.08±2.32）kg/m2。兩組對象均長期生活于浙南地區，飲食結構相似，無特殊飲食習慣；兩組對象性別、年齡、BMI比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。納入標準：依據英國腦庫帕金森病診斷標準[12]，并由經驗豐富的神經內科醫師確診。排除標準：惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全、急性心力衰竭等嚴重基礎疾病者；嚴重消化道疾病史；胃腸手術病史；3個月內服用過抗生素和益生菌。本研究經溫州市人民醫院醫學倫理委員會批準，兩組對象或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PD組臨床資料和評價的收集 收集PD組患者病史資料。采用Hoehn＆Yahr分級量表（H-Y分級）和統一帕金森病評分量表第三部分（unified Parkinson's disease rating scale Ⅲ，UPDRS Ⅲ）進行臨床分類，以評估疾病進展和運動功能損傷。由神經內科醫師對PD組患者進行非運動癥狀的評估，包括簡易精神狀態檢查量表（mini-mental state examination,MMSE），漢密爾頓抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）24 項版，漢密爾頓焦慮量表（hamilton anxiety scale，HAMA），帕金森病自主神經癥狀量表（the scale for outcomes in PD for autonomic symptoms，SCOPA-AUT），Wexner便秘評分[13]。

1.2.2 糞便標本微生物分類分析 采用統一的無菌一次性便盒在醫院或家中采集糞便標本，并儲存于微生物檢測試劑盒（杭州金源生物技術公司）。使用糞便基因組DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司，DP328），按照說明書要求，對糞便標本提取DNA。使用特定設計的細菌PCR擴增引物對糞便標本中的16S rDNA進行PCR擴增，具體引物序列如下：正向引物：5'-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，反向引物：5'-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'。使用 Miseq儀器（美國Illumina公司）進行細菌16S rDNA高通量測序。

1.2.3 兩組對象腸道菌群的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和Alpha多樣性分析 過濾處理測序原始數據后，得到OTU。基于樣本OTU，分析菌群Alpha多樣性，計算Chao1指數，Shannon指數、Simpson指數及Good's coverage等參數。它們分別用于反映菌群的豐度；估算樣品中微生物的多樣性；反映一個樣品中任意兩條序列不屬于同一個物種的概率；估算各樣文本庫的覆蓋率。

1.2.4 兩組對象門、屬水平腸道菌群豐度的比較 根據OTU物種注釋，以及每個OTU的序列數，計算兩組對象腸道菌群的豐度；根據分類學信息，從門水平和屬水平分析比較兩組腸道菌群的豐度。

1.2.5 兩組對象差異菌群與PD組臨床特征的相關性分析 分析兩組間差異菌群與PD組病程、運動癥狀、非運動癥狀等臨床特征的相關性。

1.3 統計學處理 使用R（v3.6.1）語言軟件進行分析。在Rstudio界面，符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。PD組患者腸道菌群豐度與臨床癥狀之間的關系采用Spearman秩相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD組臨床資料和評價結果 PD組病程為（5.54±3.5）年，H-Y 分級為（2.11±0.65）級，UPDRS Ⅲ評分為（25.31±10.37）分，MMSE 評分為（26.94±2.48）分，HAMD評分為（18.67±9.76）分，HAMA 評分為（12.25±6.55）分，SCOPA-AUT 評分為（28.08±8.26）分，Wexner便秘評分為（9.28±6.3）分。

2.2 兩組對象腸道菌群的OTU和Alpha多樣性分析比較 見表1。

由表1可見，PD組與HC組OTU數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數、Good's coverage反映的菌群多樣性比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表1 兩組對象腸道菌群的OTU和Alpha多樣性分析比較

2.3 兩組對象門水平腸道菌群豐度比較 見表2。

由表2可見，在門水平上，PD組疣微菌門、黏膠球形菌門、異常球菌門的豐度高于HC組，差異有統計學意義（均 P＜0.05）。

表2 兩組對象門水平腸道菌群豐度比較（%）

2.4 兩組對象屬水平腸道菌群豐度比較 見表3。

由表3可見，PD組中毛螺旋菌屬、伯勞特菌屬、鏈球菌屬、克雷伯菌屬豐度明顯低于HC組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。PD組中埃希菌屬、瘤胃球菌屬、巨單胞菌屬、阿克曼菌屬、巨型球菌屬、顫桿菌屬、伯克菌屬、埃森博格拉菌屬、異味桿菌屬、丹毒絲菌科未命名屬、脫硫弧菌屬、普雷沃菌屬、單胞菌屬、脫硫弧菌科未命名屬、嗜胨菌屬豐度高于HC組，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。

表3 兩組對象屬水平腸道菌群豐度比較（%）

2.5 兩組對象差異菌群與病程、運動癥狀的相關性分析 見表4。

由表4可見，PD組與HC組間的差異菌屬分別與帕金森病病程、運動癥狀進行相關分析，結果顯示UPDRS Ⅲ與脫硫弧菌屬呈正相關（rho=0.482，P=0.023）。

表4 兩組對象差異菌群與病程、運動癥狀的相關性分析

2.6 兩組對象差異菌群與非運動癥狀的相關性 見表5。

由表5可見，將PD組與HC組間差異菌屬分別與PD非運動癥狀進行相關分析，HAMA與鏈球菌屬呈正相關，HAMA、HAMD與巨型球菌屬呈正相關；MMSE與埃森博格拉菌屬呈負相關；SCOPA-AUT與普雷沃菌屬呈負相關。

表5 兩組對象差異菌群與非運動癥狀的相關性

3 討論

帕金森病是一種以中腦黑質多巴胺能神經元退行性病變為特征的神經變性性疾病。在神經系統不同區域的神經元內存在的含有α-突觸核蛋白的路易小體是帕金森病病理診斷重要的相關標志物[14-16]。Braak等[2]根據帕金森病患者的病理學研究提出帕金森病腦-腸軸受累的假設，越來越多證據表明胃腸道和腸神經對帕金森病的發展有重要作用。腦-腸軸是中樞神經系統和胃腸道之間的雙向通信系統。新近研究提出腸道菌群可能影響胃腸-腦相互作用[17-19]。

本研究分析結果發現PD組與HC組在菌群多樣性上比較無統計學意義。這與Pietrucci等[20-21]的研究結果一致。從門水平上看，本研究結果顯示PD組患者糞便中疣微菌門、黏膠球形菌門、異常球菌門的豐度較高，其中，疣微菌門比例比較高，作用可能比較大。既往國外研究結果顯示了帕金森病腸道菌群中疣微菌門豐度較高[22]，與本研究結果一致。從屬水平上看，本研究結果發現PD組毛螺旋菌屬、伯勞特菌屬的豐度較少。這兩種細菌均參與調節產生短鏈脂肪酸[17，23-27]。短鏈脂肪酸是菌群代謝的主要產物,不僅起到穩定菌群結構的作用，還參與腸道免疫、動力和腸上皮屏障的調節[28]。既往一些研究已經表明在帕金森病患者腸道中缺乏短鏈脂肪酸，這可能與帕金森病患者腸道調節產生短鏈脂肪酸的菌群減少有關[29-30]。本研究關注到PD組腸桿菌科中的埃希菌屬和阿克曼菌屬豐度明顯升高，這與之前的研究結果一致[31-32]。埃希菌屬是革蘭陰性菌，而脂多糖是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，它可以誘導產生促炎性細胞因子。Small等[33]發現在克羅恩病中持續感染黏附侵襲性埃希菌可以導致慢性、持續性外周炎癥。而阿克曼菌被認為可以降解腸道黏液層[34]，導致微生物抗原暴露于免疫細胞，從而可能具有炎癥潛力。這兩種細菌可能促進了帕金森病患者腸道炎癥反應和腸黏膜屏障的破壞。

相關性分析結果顯示UPDRS Ⅲ與脫硫弧菌屬豐度呈正相關性。Tomova等[35]的研究發現自閉癥兒童腸道中脫硫弧菌增加的趨勢，其豐度與自閉癥孤獨癥診斷訪談的限制/重復行為評分嚴重程度有明顯的相關性。從非運動癥狀量表相關性結果來看，SCOPA-AUT與普雷沃菌屬豐度呈負相關性；同樣在特發性快速眼動睡眠行為紊亂患者中腸道普雷沃菌下降，提示普雷沃菌可能對帕金森病非運動癥狀有影響[36]。MMSE與埃森博格拉菌屬豐度呈負相關性；HAMA與鏈球菌屬呈正相關性，HAMA、HAMD均與巨型球菌屬豐度均呈正相關性。有研究發現精神分裂癥患者巨型球菌豐度較HC組明顯升高，說明巨型球菌可能與帕金森病精神行為功能相關[37-38]。

本研究尚有許多不足，包括采用橫斷面研究方法，納入的帕金森病患者較少，未進行不同臨床分型的分類比較和不同階段菌群動態分析比較，僅初步證實了帕金森病患者與健康人群之間的腸道菌群差異。Sampson等[24]發現無菌的帕金森病小鼠模型的運動障礙癥狀比正常菌群的帕金森病小鼠模型癥狀更輕；將帕金森病患者的腸道菌群轉移至無菌的帕金森病小鼠模型，其運動障礙癥狀則加重。但目前國內外關于帕金森病腸道菌群結構尚不統一，無法歸納出其典型菌群分布特點，腸道菌群被認為只是帕金森病發病機制中的影響因素之一。

綜上所述，帕金森病患者與健康人群之間的腸道菌群存在明顯差異。帕金森病腸道菌群中致炎病菌的增多及短鏈脂肪酸產生菌減少，而且差異菌群與帕金森病的臨床特征有一定相關性。但是具體的作用機制尚不明確，還需進一步深入研究，本研究為帕金森病患者診斷的生物標志物提供新方向，為腸道菌群的靶點治療方法應用提供依據。