葛根總黃酮對佐劑性關節炎大鼠免疫器官指數、IL-1β及TNF-α的影響分析

柏 琳，鄒天琪，張成義

(北華大學藥學院，吉林 吉林 132000)

葛根主要活性成分有皂苷、黃酮、多糖、生物堿等。葛根總黃酮包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷酮。目前研究發現，黃酮類化合物具有抗炎、清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等功效[1]。因此可推測葛根總黃酮具有一定的抗炎活性。本研究采用弗氏完全佐劑建立佐劑性關節炎大鼠模型，探討葛根總黃酮對佐劑性關節炎大鼠免疫器官指數、IL-1β及TNF-α的影響。

1 資料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：清潔級雄性SD大鼠60只，體質量190～210 g，購于長春億斯實驗動物技術有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK(吉)2018-0001。燈光模擬晝夜交替，溫度23～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和進食。

1.1.2主要試劑：葛根總黃酮購自四川維克奇生物科技有限公司，甲氨蝶呤片購自上海信誼藥廣有限公司，弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司，IL-6酶聯免疫吸附試劑盒和TNF-α酶聯免疫吸附試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1分組與模型制備：實驗動物分組：60只SD大鼠，適應性喂養1周后，采用隨機數字法分為正常對照組12只，模型組48只。

1.2.2給藥劑量和方案：葛根總黃酮：大鼠(50 mg/kg、100 mg/kg)；陽性對照藥甲氨蝶呤：大鼠(3 mg/kg)；通過查閱相關文獻并參照前期預實驗，給藥劑量均為人體常用有效劑量經體表面積折算。將不同濃度的葛根總黃酮混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉中，在對應組致炎后(第12天)連續給藥16 d(第12～28天)，均按10 ml/kg計量灌胃給藥，正常對照組和模型組給予等量溶媒0.5%的羧甲基纖維素鈉灌胃，1次/d。

1.2.3大鼠免疫器官指數測定：造模后第28天，摘取大鼠脾臟和胸脾，生理鹽水反復沖洗后，紗布吸干，使用分析天平稱量濕重，計算免疫器官指數，包括脾臟指數和胸脾指數。計算公式為免疫器官指數=器官濕重(mg)/體重(g)×100%。

1.2.4大鼠血清IL-1β和TNF-α水平檢測：造模后第28天，心臟采血5 ml，注入離心管中，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min離心20 min，采集上層血清，-20 ℃保存待測。采用酶聯免疫吸附法測定血清IL-1β、TNF-α水平，按試劑盒說明書依次加入反應液，上酶標儀讀取450 nm處的吸光度值。同時使用標準品繪制標準曲線，將吸光度值代入標準曲線方程計算出相應的濃度。

1.3統計學方法：統計分析采用SPSS 24.0軟件分析。計量數據為均數Mean、標準差STD、中位數Median，采用雙樣本t檢驗比較兩組間計量數據的統計學差異，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1葛根總黃酮對佐劑性關節炎大鼠多發性關節炎的影響：模型組大鼠多發性關節炎指數明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；自給藥干預20 d后，與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽性對照組大鼠的多發性關節炎指數明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；其中葛根總黃酮高劑量組和陽性對照組大鼠多發性關節炎指數明顯低于葛根總黃酮低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；大鼠多發性關節炎指數在葛根總黃酮高劑量組與陽性對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同給藥時間各組大鼠多發性關節炎指數比較

2.2葛根總黃酮對佐劑性關節炎大鼠免疫器官指數的影響：給藥干預28 d后，模型組大鼠脾臟指數、胸脾指數均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽性對照組大鼠的脾臟指數、胸脾指數均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；其中葛根總黃酮高劑量組和陽性對照組大鼠脾臟指數、胸脾指數明顯低于葛根總黃酮低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；大鼠脾臟指數、胸脾指數在葛根總黃酮高劑量組與陽性對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 干預28 d后各組大鼠免疫器官指數比較

2.3葛根總黃酮對佐劑性關節炎大鼠血清IL-1β和TNF-α的影響：給藥干預28 d后，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽性對照組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；其中葛根總黃酮高劑量組和陽性對照組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯低于葛根總黃酮低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；大鼠血清IL-1β、TNF-α在葛根總黃酮高劑量組與陽性對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 給藥干預28 d后各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較

3 討論

佐劑性關節炎動物模型能夠較好地模擬人的類風濕性關節炎表現，其中大鼠佐劑性關節模型應用最為廣泛，適用于研究和篩選抗炎免疫藥物。繼發性足腫脹、多發性關節炎時反映大鼠繼發性炎性反應的兩個主要指標。相關研究顯示，中樞免疫器官胸腺功能異常是類風濕性關節炎的主要發病機制之一，胸腺是T細胞分化、成熟的場所，當其功能異常時會影響T細胞水平，影響人體正常的免疫炎癥狀態[2]。除胸腺之外，脾臟是另一個功能復雜的免疫器官，在人體神經內分泌免疫調節中發揮重要作用[3]。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，胸腺和脾臟指數水平取決于淋巴細胞增殖的程度，可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱[4]。關節炎發病早期IL-1β、TNF-α是關鍵調控分子[5]。相關研究顯示，IL-1在類風濕性關節炎的發病過程中發揮重要調控作用，其水平與類風濕性關節炎病情嚴重程度呈正相關[6]。IL-1主要由IL-1α、IL-1β兩種蛋白質組成，兩者的基因序列同源性并不高，其中IL-1β在類風濕性關節炎中高表達，能夠激活軟骨細胞、內皮細胞、白細胞，誘發趨化因子、細胞因子的釋放[7]。同時還能夠調控內皮細胞黏附分子表達，合成并分泌急性期蛋白，提升糖代謝水平，引發鈣流失、發熱、關節炎性反應和骨破壞。TNF-α是類風濕性關節炎滑膜組織中主要的促炎因子，能夠引發級聯反應；患者血清TNF-α水平提升會增加滑膜炎、關節損壞的發生等下。TNF-α還能夠活化內皮細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞，誘導趨化因子、細胞因子、基質金屬蛋白酶等合成與分泌，抑制滑膜膠原合成及成纖維細胞增殖，誘導產生急性期蛋白，促進血管生成和T細胞活性提升，誘發疼痛[8]。近年來研究發現，IL-1β 和 TNF-α在直接引發關節損傷和全身性炎癥反應的同時，還能夠與其他炎性介質之間產生協同作用，誘發級聯放大反應[9]。

葛根是我國的傳統中藥材，是野葛干燥的根，具有生津止渴、解肌退熱之功效。葛根總黃酮由葛根素、大豆甙等黃酮類化合物組成，是葛根發揮藥效學作用的主要活性成分。本研究成功建立了佐劑性關節炎大鼠模型，并以甲氨蝶呤干預作為陽性對照組。研究結果顯示，葛根總黃酮低劑量組和高劑量組均能夠明顯抑制佐劑性關節炎大鼠繼發性足腫脹，降低多發性關節炎指數和脾臟指數、胸脾指數，其中葛根總黃酮高劑量組大鼠改善效果較葛根總黃酮低劑量組大鼠更明顯，與甲氨蝶呤陽性對照組無明顯差異。提示葛根總黃酮能夠有效改善佐劑性關節炎大鼠的癥狀，且改善效果呈劑量依賴性，隨著給藥劑量的增加效果逐漸明顯。進一步分析顯示，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯高于正常對照組；與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽性對照組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明顯下降；其中葛根總黃酮高劑量組下降最明顯，與陽性對照組無明顯差異。提示葛根總黃酮能夠明顯下調佐劑性關節炎大鼠致炎因子IL-1β、TNF-α的表達，降低大鼠血清中致炎因子含量，進而改善炎癥癥狀。

綜上所述，葛根總黃酮能夠降低佐劑性關節炎大鼠繼發性足腫脹，改善免疫器官指數，降低佐劑性關節炎大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，上述結論可為相關研究奠定理論基礎。