接種嗜熱側孢霉對堆肥木質纖維素降解的影響

羅曉莎 王明明 宋頎 陳舒 錢俊偉

摘要 以豬糞和木屑為堆肥試驗材料，研究接種嗜熱側孢霉對堆肥溫度、pH、含水量、木質纖維素相對含量、纖維素相關酶活及細菌、真菌群落結構的影響。結果表明，與對照組相比，接菌組升溫較快，在堆肥第1天就達到了50 ℃，達到高溫期后含水量下降較快。堆肥結束時，接菌組的纖維素和半纖維素相對含量分別下降了8.50%和16.86%，分別高于對照組的1.50%和13.53%。酶活分析表明，接菌后，β-1，4-葡聚糖酶活性明顯提高，木聚糖酶活性出現3個峰值，其中最大峰值為7.90 U/g，是對照組的最大峰值的2.62倍。錳過氧化物酶的活性也有明顯提高。接種嗜熱側孢霉在一定程度上也影響了堆肥的細菌及真菌群落結構變化。由此可見，在堆肥中接種嗜熱側孢霉可以加快堆肥升溫，促進有機質分解和轉化。

關鍵詞 堆肥;嗜熱側孢霉;纖維素酶活;微生物群落

中圖分類號 S141.4文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）02-0063-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.019

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Inoculating Thermophilic sporotrichum on Lignocellulose Degradation in Composting

LUO Xiaosha1，WANG Mingming1，2，SONG Qi1 et al

（1. BGI Institute of Applied Agriculture， BGIshenzhen， Shenzhen，Guangdong 518000;2.BGI Sanshengyuan Co. Ltd.， BGIShenzhen， Shenzhen，Guangdong 518000）

Abstract Using pig manure and sawdust as compost test materials， the effects of inoculation hermophilic sporotrichum on compost temperature， pH， water content， relative lignocellulose content， celluloserelated enzyme activity， and bacterial and fungal community structure were studied.The results showed that compared with the control group， the temperature of the inoculated group was faster， reaching 50°C on the first day of composting， and the water content decreased faster after reaching the high temperature period.At the end of composting， the relative contents of cellulose and hemicellulose in the inoculated group decreased by 8.50% and 16.86%， respectively， which were higher than 150% and 13.53% in the control group.The enzyme activity analysis showed that after the inoculation， the β1，4glucanase activity was significantly increased， and there were 3 peaks in the xylanase activity， of which the maximum peak was 7.90 U/g， which was 2.62 of the maximum peak of the control group. The activity of manganese peroxidase was also significantly improved.The inoculation Thermophilic sporotrichum also affected the changes in the bacterial and fungal community structure of the compost to a certain extent.It can be seen that the inoculation Thermophilic sporotrichum in the compost can speed up the temperature of the compost and promote the decomposition and transformation of organic matter.

Key words Compost;Thermophilic sporotrichum;Cellulase activity;Microbial community

近年來，規模化養殖發展迅速，畜禽糞便產生量突增，2015年我國畜禽糞便產生量已達到60億t[1]。畜禽糞便中含有未消化的淀粉、蛋白質等大分子營養物質，同時還有豐富的有機質、磷、氮和鉀元素等，未經處理直接排放到環境中，不僅會造成養分的流失，還會對水源、大氣和土壤環境造成嚴重的污染。現在畜禽糞便的主要處理方式有填埋法、焚燒法和堆肥法[2-3]。堆肥作為一種有效的處理有機廢棄物的方法，可以利用微生物將有機物質快速降解成為穩定的有機營養物質或者腐殖質，實現廢棄物資源的再利用[4]。

傳統的堆肥發酵存在著發酵周期長、升溫慢、腐熟不徹底等問題，這些問題與木質纖維素的降解緊密相關，因此如何加快堆肥進程中木質纖維素的降解一直是領域內研究熱點[5-6]。有研究報道，加入功能微生物菌劑可以調節微生物群落結構，提高微生物活性，加速堆肥腐熟進程[7-8]。劉佳等[9]研究發現在牛糞堆肥中接種纖維素降解菌，加快了堆肥中的微生物增殖，縮短堆肥進程。尹靜等[10]研究篩選了一株粉紅粘帚霉，應用于堆肥中可促進堆肥腐熟，提高堆肥產品腐植酸含量。Wei等[8]在小麥、玉米和大豆堆肥中接種嗜熱放線菌，結果表明放線菌的接種不僅改變了放線菌和細菌群落的結構，而且加速了纖維素、半纖維素和木質素的降解，并增加了堆肥（特別是小麥）中纖維素、半纖維素和木質素的關鍵酶活性。盡管這些研究取得了一定的促進堆肥進程的效果，但是更有效的功能性微生物產品仍需要進一步探索。

有文獻報道，嗜熱側孢霉（Thermophilic sporotrichum）是一種分解纖維素的嗜熱絲狀真菌[11]。由于嗜熱側孢霉代謝作用快，纖維素降解率較高，同時較高的生長溫度可以有效地抑制其他微生物的生長，在發酵生產上占有一定的優勢，因此嗜熱側孢霉日益受到研究者的重視[12]。但是目前大部分研究都集中在嗜熱側孢霉的生物學特性和液體發酵上，對其在堆肥中的應用研究較少。

該試驗以豬糞和木屑為堆肥原料，通過探究加入嗜熱側孢霉對堆肥中溫度、含水率變化、木質纖維素的降解特性及真菌、細菌群落結構的影響，以期發現新的對縮短堆肥發酵周期、提高木質纖維素降解率有顯著作用的外源堆肥菌劑，也為進一步研究嗜熱真菌在堆肥木質纖維素降解機制中起到的重要作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用菌種為嗜熱側孢霉D1，自前期羊糞堆肥樣品中篩選出。堆肥原料為新鮮豬糞，選用楊木木屑作為調理劑，購自網上，豬糞取自廣東惠州豬場。堆肥原料性質見表1。

1.2 堆肥設置

堆肥試驗在華大農業大鵬試驗基地進行，實行人工翻堆。共設置2個堆體，每個堆體高約1.2 m，直徑約1.5 m。將豬糞與木屑按體積比3∶2混合，接菌組堆體接種1%的嗜熱側孢霉D1，攪拌均勻，將不接種的堆體作為空白對照組。堆體溫度上升到50 ℃之后開始翻堆，高溫期每2 d翻堆一次，溫度下降到35 ℃之后每5 d翻一次，每天測定堆體上部（40 cm）、中部（70 cm）、下部（100 cm）的溫度和室溫。堆肥周期為50 d。

1.3 樣品采集與指標檢測

在堆肥的0、2、6、8、10、15、20、25、30、35、40和50 d取樣，在上、中、下層隨機取樣，將取得的樣品均勻混合，四分法保留300 g，密封置-20 ℃保存，以備分析測定待用。將樣品風干粉碎后進行含水量、pH、碳氮比、全氮等指標的測定。測定方法根據中華人民共和國有機肥料農業行業標準NY 525—2012進行。纖維素、半纖維素和木質素相對含量的測定采用范式洗滌法。

1.3.1 堆肥基因組DNA的提取。

使用試劑盒Fast DNATM Spin Kit for soil提取堆肥樣品DNA。

1.3.2 纖維素酶活的檢測。

取0、2、4、6、8、10、15、20、25、30 d的樣品進行酶活測定：纖維素酶測定采用3，5-二硝基水楊酸法;錳過氧化物酶測定采用Mn2+法;纖維二糖酶測定采用S-C1催化法;木聚糖酶測定采用DNS法[13]。

1.3.3 Illumina Miseq高通量測序。

提取微生物總DNA（濃度>10 ng/μL，總量>500 ng，OD260/280=1.8～2.0），進行目標片段PCR擴增：選取338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）作為細菌16S rRNA 引物;選取1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）作為真菌ITS引物。PCR產物送往深圳華大基因公司測序平臺進行上機測序和測序結果分析。

2 結果與分析

2.1 堆肥過程中溫度的變化

在堆肥過程中，溫度是一個十分重要的參數，能反映出微生物的活躍程度，故溫度的變化與有機物的降解密切相關[14]。從圖1可以看出，2組堆肥的溫度變化均呈現了先升高后降低最后趨于穩定的變化趨勢，與許多文獻中報道的一致[15-16]。此次試驗中，接菌組堆肥溫度超過50 ℃的時間達30 d，對照組的也達到了29 d，長期保持堆體高溫可以充分殺死堆肥中的病原微生物和蟲卵等，從而達到糞便無害化標準[17]。

在堆肥初期，堆體自帶的微生物通過分解有機物，為自身的大量增殖提供營養物質，這一過程會產生大量熱量，從而導致溫度迅速上升[18]。與對照組相比，接菌組初期升溫較快，在堆肥第1天，溫度就達到了51 ℃，對照組第1天溫度為48 ℃，接菌組高溫期平均溫度高于對照組，且最高溫度達74 ℃，比對照組最高溫度（69 ℃）高出5 ℃，可能是由于嗜熱側孢霉可以在高溫下生存，并且分解了堆肥原料種的木質纖維素，產生一定熱量，從而提高了堆肥的溫度。2組高溫期分別維持了30和29 d，隨著有機質的大量消耗，微生物代謝活動減慢，熱量減少，2組溫度在第33天迅速下降至43 ℃，然后緩慢下降至室溫。

2.2 堆肥過程中含水量和pH的變化

由表1可知，堆肥過程中pH呈現一個先升高后緩慢降低的趨勢，接菌組和對照組開始時（0 d）的pH分別為6.44和6.47，結束時（50 d）的pH分別為7.21和7.19，接菌組pH最高峰出現在第6天，為8.88，而對照組pH最高峰出現在第30天，為7.96。接菌組pH在前10 d明顯高于對照組，這與溫度趨勢一致。發酵前期接菌組有機物分解較快，富氮有機物分解出氨，導致pH明顯升高。

從圖2可以看出，在整個堆肥過程中，2組堆體的含水率皆呈下降趨勢，接菌組和對照組的起始含水率分別為69.6%和67.7%，試驗結束時，接菌組和對照組的含水率分別為375%和38.0%，兩者沒有明顯差異，高溫期接菌組含水率低于對照組，可能是由于堆體溫度較高，加速了水分喪失。

2.3 堆肥過程中木質纖維素含量的變化

木質纖維素物質的降解是堆肥過程中的關鍵環節。由圖3可知，2組堆肥中纖維素和半纖維素的相對含量皆有所降低，在接菌組中，堆肥結束時的纖維素相對含量比堆肥開始時的下降了8.5%，高于對照組的1.5%;半纖維素的相對含量比堆肥開始時的下降了16.9%，高于對照組的13.5%，說明接種嗜熱側孢霉更利于纖維素的降解。而木質素由于其高度復雜和相對隨機排列的分子結構，相對于纖維素和半纖維素更難降解[19-20]。由圖3可知，2組堆肥中的木質素相對含量皆不降反升，可能是由于木質素的降解率低于其他物質，堆肥總體質量降低，故木質素的相對含量增加。王偉東等[21]的試驗也有證明木質素在堆肥中幾乎不發生降解，加入復合菌系也未見明顯影響。

2.4 堆肥過程中酶活的變化

在堆肥中，木質纖維素物質的降解都是在微生物及各種酶的作用下進行的[22-23]。β-1，4-葡聚糖酶（又稱纖維二糖水解酶）是一種重要的纖維素降解酶，主要作用于纖維素線狀分子末端，水解β-葡萄糖苷鍵，切下一個纖維二糖分子之后，纖維二糖分子被β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖分子[24]，故β-1，4-葡聚糖酶酶活變化與纖維素的降解密切相關[25]。從堆肥過程中β-1，4-葡聚糖酶酶活的變化趨勢（圖4a）可以看出，2組堆肥的β-1，4-葡聚糖酶的酶活變化趨勢基本一致，皆出現3次高峰。2組最大峰值皆出現在第25天，其中接菌組的最大峰值為252.18 U/g，高于對照組的最大峰值（236.55 U/g）。接菌組的β-1，4-葡聚糖酶活性在堆肥全程均明顯高于對照組，峰值皆出現在堆肥高溫期，說明嗜熱側孢霉對β-1，4-葡聚糖酶酶活具有明顯的促進作用，且有較強的耐高溫能力，這對于提高纖維素的降解率十分重要。

與纖維素一樣，半纖維素的降解也需要在相關酶的作用下完成。木聚糖酶是分解半纖維素的酶中一類主要的酶系，包括多種木聚糖內切酶和外切酶，能催化水解木聚糖，分解原料細胞壁以及β-葡聚糖，從而促進營養物質的吸收利用和有效物質的釋放[26]。從圖4b可以看出，接菌組的木聚糖酶酶活在堆肥過程中出現了3個峰值，分別出現在第10、20、30天，其中最大峰值出現在第30天，為7.90 U/g，此時堆肥溫度為52 ℃;對照組的酶活峰值出現在第2天，為3.01 U/g，此時對照組堆肥的溫度為49 ℃，表明50 ℃左右的溫度可能是木聚糖酶反應的最適溫度，這與馮焱等[27]的研究結果大致相同，同時也說明接種嗜熱側孢霉對木聚糖酶酶活具有明顯的促進作用，有助于堆肥中半纖維素類物質的降解。

木質素結構復雜，在自然條件下很難分解或者基本不分解[28]，在堆肥中降解率明顯低于纖維素和半纖維素[29]。在分解木質素的酶系中，錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶被認為是最為重要的3類酶。其中錳過氧化物酶能氧化木質素中約占10%的酚結構，催化氧化Mn2+生成Mn3+，Mn3+能夠穿透木材，氧化酚型有機物[30]，在木質素降解中起重要作用。從圖4c可以看出，在堆肥剛開始的前15 d，錳過氧化物酶酶活較低，對照組樣品中檢測不到，而接菌組在第6天和第10天能檢測到的錳過氧化物酶酶活分別為0.009和0016 U/g。從第15天開始，2組的錳過氧化物酶酶活均有一定上升，出現2個波峰。2組酶活最大值皆出現在堆肥第30天，接菌組的最大值達到0.359 U/g，是對照組最大值（0.136 U/g）的2.64倍。表明接種嗜熱側孢霉可以提高錳過氧化物酶活性，對加速木質素類物質的分解有一定的促進作用。

2.5 堆肥過程中微生物動態變化

從圖5可以看出，在門水平下，2組堆肥樣品中相對豐度超過1%的細菌群落結構相似，主要細菌菌群包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bcateroidetes）、芽孢桿菌門（Gemmalimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、棲熱菌門（Thermi）、藍藻門（Cyanobacteres）、軟壁菌門（Tenericutes）和互養菌門（Synergistetes）。其中變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、芽孢桿菌門、放線菌門和綠彎菌門是主要的優勢菌群。這與王秀紅等[31]的研究結果大致相同。

厚壁菌門是一類重要的水解酸化細菌，可以分泌胞外酶分解多種大分子有機物[32]。在堆肥初期，厚壁菌門細菌相對豐度較大。堆肥第2天，對照組和接菌組中厚壁菌門的相對豐度分別為70.5%和91.3%，表明堆肥初期的大分子有機物主要在厚壁菌門細菌的作用下迅速降解成為小分子有機物，接菌后促進了厚壁菌門細菌的生長;但是堆肥10 d后，厚壁菌門細菌的相對豐度逐漸減少，可能是因為溫度升高導致厚壁菌門細菌大量死亡。放線菌是一類耐高溫的細菌，可在高溫的環境下利用分解木質纖維素進行大量增殖[33-34]。在此次研究中，堆肥前期雖然也有放線菌出現，但是所占比例并不大，從第10天起，放線菌迅速增殖，并且在堆肥中后期仍保持一定的數量優勢;在堆肥第25天，接菌組放線菌門的相對豐度為59.7%，高于對照組，此時分解纖維素的相關酶活性皆出現了最高波峰（圖4a）。表明放線菌的增殖促進了纖維素的降解。綠彎菌門細菌也是一類可以降解纖維素類物質的細菌[35]。在此次研究中，綠彎菌門在堆肥中后期才成為優勢菌群。接菌組中的綠彎菌門相對豐度略高于對照組。

從圖6可以看出，在屬水平下，2組的真菌群落結構也有所不同。在發酵前2 d，2組樣品中毛孢子菌屬、節擔菌屬和假絲酵母屬為優勢菌群。到第10天，糞盤菌屬（Ascobolus）成為主要優勢菌群。Ascobolus是子囊菌綱中盤菌亞綱的一個屬。在2組堆肥的整個發酵過程中，Ascobolus始終存在。有報道表明嗜熱側孢霉（Sporotrichum thermophile）歸于毀絲菌霉屬（Myceliophtora）;Myceliophtora具有較高的產木聚糖酶和纖維素酶活性[36]。在該研究中，在堆肥第25天開始，Myceliophtora占比增加，而接菌組的Myceliophtora相對豐度迅速增加至68.3%，說明在此時Myceliophtora大量繁殖是由于接種了嗜熱側孢霉的緣故，也驗證了該試驗所選用的嗜熱側孢霉在堆肥中適應能力較強，作為接種物添加到堆肥中能加快其在高溫期的定殖，對纖維素類物質的降解起到加速的作用。

3 討論

堆肥是一個微生物參與的復雜的物質轉化過程，其中木質纖維素類物質的降解是眾多研究者關注的重點和難點。促進木質纖維素降解的途徑有很多，但是外源補充功能性微生物是一條更為環保和生態的途徑。該研究將一株嗜熱側孢霉接種于豬糞木屑堆肥中，接菌組達到高溫的速度快，并且高溫期持續時間長，說明接菌后促進了堆肥的快速啟動和微生物的代謝作用，產熱增多，提高了堆體中有機質的分解效率。同時，高溫期延長，嗜熱側孢霉繁殖加快，代謝水平提高，大量纖維素酶類隨之產生，纖維素酶和纖維二糖酶的酶活皆出現3次高峰。且與對照組相比，接菌組的纖維素酶和纖維二糖酶的酶活最大峰值出現時間較早，峰值較高。堆肥結束時纖維素的相對含量也低于對照組，說明接種嗜熱側孢霉有利于促進纖維素類物質的降解。在分解半纖維素物質中起主要作用的木聚糖酶酶活在第30天出現最大峰值，而對照組木聚糖酶酶活最大峰值出現在堆肥第2天，且遠遠低于接菌組。說明接種嗜熱側孢霉對木聚糖酶酶活具有顯著促進作用，有助于堆肥中半纖維素類物質的降解。相對于纖維素和半纖維素來說，木質素更難降解，其相對含量在堆肥結束時甚至有所增長，這可能是由于木質素的降解率低于其他物質，堆體總質量降低，故木質素的相對含量增加。此結果與王涵[37]的研究結果相符。但接菌組中木質素相對含量的增長幅度要小于對照組。說明接菌處理對木質素的降解也有一定的積極作用。在門水平下，2組堆肥樣品中相對豐度超過1%的細菌群落結構相似。變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、芽孢桿菌門、放線菌門和綠彎菌門是主要的優勢菌群。在屬水平下，2組的真菌群落結構有所不同。高溫期接菌組的嗜熱側孢霉相對豐度迅速增加，成為最主要的優勢菌群，代謝活動加快，而β-1，4-葡聚糖酶活性在此時也明顯提高。說明嗜熱側孢霉在一定程度上影響了堆肥的真菌群落結構，加速了纖維素類物質的降解。

4 結論

該研究以豬糞和木屑為堆肥原料，接種嗜熱側孢霉后，促進了堆肥的快速啟動，延長了高溫期并提高了溫度峰值，明顯提高了纖維二糖酶和木聚糖酶的活性，促進了堆體纖維素和半纖維素類物質降解，有利于促進堆肥腐熟，提高堆肥品質。說明該菌株在處理高木質纖維素類農業廢棄物方面有一定的應用價值。

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