胃癌組織中CSN6的表達及臨床意義

卓長華，阮 強，林瑞榕，張和軍，楊春康

(1.福建省腫瘤醫院，福建醫科大學附屬腫瘤醫院胃腸腫瘤外科，福建 福州 350014；2.福州大學化學學院生物與醫藥專業2020級，福建 福州 350108；3.福建省腫瘤醫院，福建醫科大學附屬腫瘤醫院病理科，福建 福州 350014)

胃癌發病率在所有惡性腫瘤中位居第四位，死亡率僅次于肺癌[1]。我國是胃癌高發區，由于早期胃癌缺乏特異性的臨床表現，且我國胃鏡篩查尚未普及，約50%～70%的患者發現時處于中晚期[2]。近年來，盡管外科及輔助治療取得重大進展，但胃癌惡性度高，切除后仍易發生復發和轉移。明確侵襲轉移的分子機制，對提高早期診斷、開發新的治療靶點藥物具有重要意義。

組成型光形態發生因子9信號復合體亞基(Constitutive photomorphogenesis 9 signalosome,CSN)是動植物進化過程中高度保守的多亞基蛋白復合體，與26S蛋白酶體的19S“蓋子”亞復合體同源，是泛素-蛋白酶體通路的調節因子。CSN由8個亞基(CSN1-CSN8)組成，在多種真核生物中對蛋白質降解、信號轉導和調節細胞周期具有重要意義[3]。CSN6是CSN的亞基之一，在多種腫瘤中表達異常增高，并促進腫瘤進展[4]。目前CSN6與胃癌的關系尚未明確，本研究探討CSN6在胃癌組織中的表達及其臨床意義，現報告如上。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2019年11月～2020年2月我院手術切除的30例新鮮胃癌及癌旁組織，采用Western blot法對CSN6蛋白進行定量分析。選取2014年1月～2015年9月我院病理科存檔的170例胃癌組織及癌旁正常石蠟組織，所有患者均行根治性切除手術，采用免疫組化對CSN6蛋白進行定性分析。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2主要試劑：CSN6兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司，Western blot試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2實驗方法：Western blot法定量檢測CSN6蛋白的表達 將新鮮的胃癌及癌旁組織研碎加入RIPA細胞溶解液提取蛋白，低溫高速離心提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。將等量的總蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，轉膜至PVDF膜。5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(稀釋比1∶1 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。以GAPDH作為內參，用Image J軟件對條帶灰度值掃描分析，對蛋白進行半定量分析。

免疫組化法定性檢測CSN6蛋白的表達 將石蠟標本以4 μm切片，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精再水合，枸櫞酸鈉溶液高溫修復抗原，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性，加入一抗(稀釋比1∶1 000)在4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB溶液顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。結果判讀：CSN6主要定位于細胞質。根據細胞染色強度計分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據陽性細胞所占百分比計分：0～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分；兩項得分相加：<3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

2 結果

2.1CSN6蛋白在胃癌新鮮組織中的表達情況：新鮮胃癌組織中CSN6的表達量為1.821±0.421，高于癌旁正常組織的0.976±0.311，差異有統計學意義(t=9.326，P<0.05)。見圖1。

注：1～3為胃癌組織，4～6為胃癌旁黏膜組織

2.2CSN6蛋白在胃癌石蠟組織中的表達情況：CSN6蛋白在胃癌及相應癌旁組織中的陽性表達率分別為55.3%和28.8%(χ2=24.440，P<0.05)，兩組差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2～3。胃癌中，CSN6的表達與性別、年齡、腫瘤部位、身體質量指數(Body Mass Index,BMI)、分化程度、神經浸潤、脈管癌栓、腫瘤大小、手術方式無關，差異無統計學意義(P>0.05)，與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、病理分期有關，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 CSN6與臨床病理特征的關系

圖2 CSN6在胃癌組織中表達表達陽性(SP×400倍)

CSN6陽性患者的5年生存率為41.6%，低于陰性患者的60.1%(χ2=10.310，P=0.001)，見圖4。單因素分析表明CSN6、分化程度、腫瘤大小、神經浸潤、脈管癌栓、浸潤深度、淋巴結轉移、病理分期與患者預后有關。多因素分析表明，CSN6、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、病理分期是胃癌預后的獨立危險因素，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 臨床病例特征與預后的關系

圖3 CSN6在癌旁正常組織中表達陰性(SP×400倍)

圖4 胃癌組織中CSN6表達陽性、陰性患者生存曲線

3 討論

胃癌的發生、發展是一個多基因、多因素、多階段的緩慢發展過程，其中基因突變及異常表達在腫瘤的形成、侵襲、轉移、腫瘤復發和耐藥等方面起著重要作用[5]。對于中晚期胃癌，單純手術切除療效往往欠佳。近年來，靶向治療成為胃癌治療的熱點，因此，需要進一步探索新的分子生物指標用于監測胃癌預后和治療。

CSN是進化保守的多蛋白復合體，存在于所有真核生物中。CSN通過調節泛素介導的蛋白質降解在細胞生長和發育過程中起重要作用，如細胞周期調控、信號轉導、轉錄激活和腫瘤發生。在CSN亞基中，CSN6含有MPN(Mpr1p和Pad1p N-終端)結構域的亞基,對調節依賴MPN末端結構域的蛋白酶體相關活性起至關重要的作用[6]。CSN6在人類多種惡性腫瘤中均出現過表達，在上尿路上皮癌患者中，CSN6陽性患者術后的復發率高于陰性患者，生存時間比陰性患者低[7]。胰腺癌中，CSN6的表達和血清糖類抗原19-9表達水平呈正相關，CSN6高表達的患者總生存期較短[8]。CSN6可促進子宮內膜癌細胞的增殖、侵襲和遷移[9]。CSN6在口腔鱗癌細胞系和組織中均顯著上調，與淋巴結、遠處轉移和不良預后密切相關[10]。然而CSN6在胃癌組織中的表達尚未研究。

本研究中，無論是定量還是定性分析，胃癌組織中CSN6的表達比癌旁組織增多，說明CSN6參與胃癌的發生。胃癌的浸潤深度越深、淋巴結轉移陽性、病理分期越高，CSN6的陽性率越高，表明CSN6參與胃癌的進展。CSN6陽性患者的5年生存率低于陰性患者，是判斷胃癌預后的獨立危險因素，因此，建議術后胃癌標本進行常規免疫組化檢測，對陽性患者進行更積極的輔助治療及復查。

CSN6致癌的作用機制尚未完全統一，目前可能的原因為：P53激活后參與誘導細胞周期凋亡，超過50%的人類惡性腫瘤與p53功能缺失、突變有關。E3泛素蛋白連接酶(MDM2)，在細胞遷移、DNA修復和細胞信號傳遞等方面發揮重要作用，同時也是p53抑癌基因的重要負調控因子。CSN6中的MPN結構域與MDM2癌蛋白直接相互作用，引起p53抑癌基因的功能受到抑制，因此，CSN6被認為會直接促進腫瘤的發生[11]。CSN6過表達導致14-3-3σ表達下調，從而激活Akt，促進細胞存活。此外，CDK抑制劑P57具有調控細胞分裂周期以避免細胞過度分裂作用，CSN6是p57的重要負性調節因子，CSN6的過度表達導致癌細胞中p57表達降低，從而促進細胞生長、分裂[12]。

本研究不足之處，樣本量相對較小，且為單中心進行回顧性研究。并未檢測血清CSN6的表達情況，無法判斷血清中CSN6的表達與預后的關系。

總之，CSN6在胃癌的發生發展中起到重要作用，是判斷腫瘤預后的重要分子生物，同時也是防治胃癌的潛在靶點。