CDC50A在宮頸癌原代細(xì)胞中的表達及對干細(xì)胞特性的影響

馬麗萍，劉小林

(連云港市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港 222023)

宮頸癌是我國目前發(fā)病率和致死率較高的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性群體的生命健康和生活質(zhì)量[1]。近年來，隨著宮頸癌篩查技術(shù)的進步以及越來越多的抗癌藥物和靶向制劑出現(xiàn)，使得宮頸癌的治療取得了長足的進展；但是部分患者仍然存在較高的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)率，預(yù)后較差，因此尋找新的治療途徑一直是宮頸癌治療領(lǐng)域長期研究的重點[3]。腫瘤的發(fā)生涉及諸多因素參與，是一個極其復(fù)雜的病理過程[4]，所有的腫瘤都起源于組織干細(xì)胞或祖細(xì)胞，雖然干細(xì)胞在組織中所占的比例極少，但卻具有強大的致瘤性、轉(zhuǎn)移性、放化療抵抗性等惡性生物學(xué)特性[5]。由于目前尚缺乏確切的宮頸癌干細(xì)胞的具體形態(tài)或腫瘤細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物，從而限制了腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)在宮頸癌治療領(lǐng)域的進展，因此尋找特異性干細(xì)胞標(biāo)志分子，有效地分離、純化干細(xì)胞，一直是腫瘤領(lǐng)域研究的熱點。目前研究較多的CSCs特異性表面標(biāo)志物包括CD44、CD24、CD133等，但是尚未發(fā)現(xiàn)宮頸癌干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志分子。有研究顯示，細(xì)胞周期蛋白50A(cell division cycle 50A，CDC50A)在宮頸癌側(cè)群細(xì)胞(side population，SP)中可能呈高表達，基于此，本項研究主要探討CDC50A在原代宮頸癌細(xì)胞中的表達以及是否具備維持腫瘤干細(xì)胞特性的功能，旨在為臨床治療提供新的研究思路?，F(xiàn)報告如下。

1 儀器與材料

1.1受試動物：Balb/c裸小鼠，8只，SPF級，雄性，4～6周齡，20～22 g，購自維通利華實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK(京)2007-0009。飼養(yǎng)在本實驗室SPF動物房內(nèi)，自由飲水進食，本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2組織來源：本項研究選取2017年1月～2018年2月期間我院婦科進行宮頸手術(shù)的宮頸癌患者24例，所有患者具有完整的臨床資料。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology et and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2009臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期5例患者，Ⅱ期13例患者，Ⅲ～Ⅳ期7例患者。同時選擇同時期在我院行子宮全切除術(shù)的正常宮頸黏膜組織10例作為對照。

1.3主要試劑：DMEM/F12腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基，美國GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞消化液(0.25%)，北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；FBS胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗，美國ThermoFisher公司；Trizol，美國Invitrogen公司；二甲基亞砜，美國Sigma公司；CDC50A單克隆抗體、IgG-PE、IgG-FITC、CD31-PE、CD45-PE、CD140a-PE、CD235a-PE，美國BD Pharmagen公司；S-P免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯仿、異丙醇、無水乙醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水，安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.4主要儀器：HERcell1501型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機以及各種型號的移液器，德國 Eppndorf公司；DI-CJ-2ND超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CX41倒置光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；電子分析天平，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴搖床，北京六一儀器廠；FACS Canto Ⅱ型流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.5實驗方法

1.5.1宮頸癌原代細(xì)胞分離及培養(yǎng)：①取宮頸癌組織標(biāo)本，置于無菌離心管中，加入DMEM培養(yǎng)液；②用無菌剪和無菌眼科鑷將組織剪成碎片；加入胰蛋白酶消化，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；③離心，棄上清；加入1 ml DMEM/F12培養(yǎng)基重懸；④經(jīng)200 μm細(xì)胞篩過濾，離心，棄上清；加入1 ml DMEM/F12培養(yǎng)基重懸；獲得單細(xì)胞懸液；⑤調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個/ml，加入至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；⑥將獲得的原代細(xì)胞培養(yǎng)在含有10 ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子和20 ng/ml上皮生長因子的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基中，將細(xì)胞置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代一次。

1.5.2流式細(xì)胞術(shù)分選：①取對數(shù)期生長的細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化2～3 min后，加入PBS吹打細(xì)胞數(shù)次，直至將細(xì)胞吹散，置入5 ml玻璃離心管中，100 rpm離心3 min，棄上清，加入PBS重懸，計數(shù)；②每組細(xì)胞分為五管，即空白對照管、同型對照管、PE補償管、FITC補償管、樣品管；③對照組不加抗體；④同型對照：取1×106個細(xì)胞加入2 μl IgG-FITC抗體，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑤PE補償管：取1×106個細(xì)胞加入CD31-PE、CD45-PE、CD140a-PE、CD235a-PE(Lin-PE)抗體各1 μl，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑥FITC補償管：取1×106個細(xì)胞加入CDC50A-FITC抗體1 μl，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；然后加入二抗，孵育10 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑦樣品管：取1×106個細(xì)胞加入CDC50A-FITC抗體、Lin-PE抗體各1 μl，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；然后加入二抗孵育10 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑧流式細(xì)胞儀進行流式檢測及分選，每組細(xì)胞設(shè)置10個平行對照，每個樣品重復(fù)檢測三次，取平均值。

1.5.3免疫組織化學(xué)染色法：按照檢測試劑盒說明書進行檢測。①取宮頸癌患者腫瘤組織或正常宮頸黏膜組織病理切片進行組織脫蠟；②抗原熱修復(fù)；③滅活內(nèi)源性過氧化物酶；④封閉；⑤加入CDC50A一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦滴加DAB試劑顯色；⑦蘇木精復(fù)染；⑧顯微鏡下觀察。采用美國universal imaging porporation圖像分析儀統(tǒng)計灰度值。

1.5.4細(xì)胞分組：將細(xì)胞分為空白對照組(未分選細(xì)胞)，CDC50A+Lin-組，CDC50A-Lin-組。

1.5.5MTT法檢測細(xì)胞增殖：將分選后的細(xì)胞(1×103個/孔)單層接種至96孔板中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組設(shè)置8個平行孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，每次取8個對照孔，每孔加入20 μl MTT，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl DMSO，置于振動器上震動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結(jié)晶物。將96孔板放置于450酶標(biāo)儀上，檢測波長為570 nm，參比波長為450 nm處的吸光光度值(OD值)，計算平均值。

1.5.6裸鼠異種移植瘤模型試驗：無菌條件下，取對數(shù)期生長的CDC50A+Lin-細(xì)胞、CDC50A-Lin-細(xì)胞和未分選的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度(1×104-1×107個/ml)，各取0.2 ml接種于裸鼠腋下皮下，同時設(shè)未接種對照組。每周觀察1次，共觀察12周。

1.5.7細(xì)胞集落形成實驗：將 CDC50A+Lin-細(xì)胞、CDC50A-Lin-細(xì)胞和未分選的細(xì)胞分別置于6孔板中，250個細(xì)胞/孔，加入完全培養(yǎng)液，放入5%CO2、飽和濕度，恒溫37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。14 d后，顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)(>50個)；計算細(xì)胞集落形成率(clony formation rate，CFR)。CFR=克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)。實驗重復(fù)三次，取平均值。形成情況。

1.5.8細(xì)胞端粒酶的制備：①收集1×1010個CDC50A+Lin-細(xì)胞、CDC50A-Lin-細(xì)胞和未分選的宮頸癌原代細(xì)胞，置于EP管中；②離心，棄上清；加入裂解緩沖液；③靜置30min后，離心，取上清，用于測定蛋白含量。

1.5.9端粒重復(fù)擴增法(Telnefic Repeat Amplification Protoeal，TRAP)結(jié)合電泳及銀染法測定端粒酶活性：①根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的資料設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；②50 μl反應(yīng)體系：10×Buffer(5 μl)，dNTP混合物(4 μl)，TaqDNA聚合酶(2U)，Ts引物(2 μl)，加入適量ddH2O至50 μl?；靹蚝笾糜?0℃水浴中孵育10 min；加入Cx引物2 μl；③95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，50℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)40次；④取下凝膠，置 10%冰乙酸，40℃固定25 min；加入去離子水清洗；⑤置于40℃ 0.2%硝酸銀溶液中染色20 min；加入去離子水清洗；⑥采用含0.02%甲醛和0.28 mmol/L碳酸鈉顯影液顯影。以未分選的Siha細(xì)胞端粒酶活性為1，其他待測標(biāo)本的端粒酶活性相對強度=待測標(biāo)本A值/未分選細(xì)胞A值。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理：本資料采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理；方差齊性采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，方差不齊采用秩和檢驗；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：宮頸癌原代細(xì)胞中表型CDC50A+Lin-的宮頸癌細(xì)胞僅占0.95%～5.64%。見圖1。

圖1 7#患者腫瘤組織中提取的原代宮頸癌細(xì)胞CDC50A+Lin-死亡流式分析結(jié)果

2.2不同組織中CDC50A的表達情況：經(jīng)免疫組化結(jié)果顯示，宮頸癌組織中CDC50A陽性表達率為87.5%，明顯高于正常宮頸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同組織中CDC50A的表達情況[例(%)]

2.3各表型細(xì)胞體外增殖情況比較：經(jīng)MTT法檢測結(jié)果顯示，CDC50A+Lin-細(xì)胞第5天呈對數(shù)生長，CDC50A-Lin-細(xì)胞第7天才出現(xiàn)指數(shù)生長，倍增時間延長，而前者第5天就出現(xiàn)指數(shù)生長的趨勢；對照組未分選原代細(xì)胞的生長能力及倍增時間介于前兩者之間。與對照組細(xì)胞比較，CDC50A+Lin-細(xì)胞的增殖活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 經(jīng)MTT法檢測各表型細(xì)胞體外增殖情況

2.4各表型細(xì)胞體內(nèi)成瘤活性比較：經(jīng)裸鼠異種移植瘤模型試驗，細(xì)胞數(shù)量為1×105-1×107個/ml時，裸鼠皮下接種CDC50A+Lin-細(xì)胞，2周就可觀察到明顯的新生腫瘤塊，成瘤率明顯高于接種對照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而接種CDC50A+Lin-細(xì)胞，觀察至12周，仍未見裸鼠形成移植瘤。見表3、見圖2。

表3 不同表型腫瘤細(xì)胞裸鼠接種成瘤能力[例(%)]

圖2 裸鼠皮下接種對照組細(xì)胞、CDC50A+Lin-細(xì)胞和CDC50A-Lin-細(xì)胞4周后移植瘤形成情況

2.5集落形成實驗：集落形成實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)14 d后，CDC50A+Lin-細(xì)胞集落形成率為(0.456±0.131)%顯著高于CDC50A-Lin-細(xì)胞集落形成率(0.073±0.04)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.241，P<0.05)。提示CDC50A+Lin-細(xì)胞克隆能力明顯高于CDC50A-Lin-細(xì)胞。見圖2。

圖2 對照組細(xì)胞、CDC50A+Lin-細(xì)胞和CDC50A-Lin-細(xì)胞培養(yǎng)14 d后細(xì)胞集落形成情況

2.6各表型細(xì)胞端粒酶活性檢測：未分選的原代宮頸癌細(xì)胞端粒酶活性作為對照(相對強度為1)，CDC50A+Lin-細(xì)胞端粒酶相對表達強度為4.79±0.78，顯著高于對照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而CDC50A-Lin-細(xì)胞端粒酶相對表達強度為0.46±0.09，顯著低于對照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A：對照組細(xì)胞；B：CDC50A+Lin-細(xì)胞；C：CDC50A-Lin-細(xì)胞；a與空白對照組比較，P<0.05；b與CDC50A+Lin-細(xì)胞比較，P<0.05

3 討論

目前，臨床上關(guān)于宮頸癌的治療仍以外科手術(shù)切除為主，配合化療和放療輔助治療。有研究認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞既是腫瘤細(xì)胞放化療耐受的根源所在，也是引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的原因之一，越來越多的婦科領(lǐng)域?qū)＜以噲D通過尋找干細(xì)胞為宮頸癌的治療開辟新的方向[6]。腫瘤干細(xì)胞的起源與正常干細(xì)胞一樣，都涉及多步驟、多階段、多因素的影響，同樣都保持未分化狀態(tài)，可自我更新和無限增殖[7]。但是不同的是，正常干細(xì)胞具有自我更新的反饋調(diào)節(jié)機制，增殖和凋亡處于平衡狀態(tài)[8]，但是腫瘤干細(xì)胞由于發(fā)生多基因突變導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，從而形成腫瘤[9-10]。腫瘤干細(xì)胞具有較強的耐藥性和高致瘤性，因此易導(dǎo)致化療失敗。

早在1997年[11]，Bonnet首先自急性粒細(xì)胞白血病患者中分離出CD34+CD38-細(xì)胞，被證實具有類似造血干細(xì)胞特性；但直到2001年[12]，Reya等才正式提出“腫瘤干細(xì)胞”的概念。在2003年，Al-Hajj等首先分離出具有自我更新能力、多向分化特性以及高致瘤性的乳腺癌細(xì)胞亞型，且這些細(xì)胞顯著高表達CD44、CD24和上皮細(xì)胞特異性抗原[13]；由此認(rèn)為CD34+、CD44、CD24可能是腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志分子。CD34+、CD44和CD24都屬于細(xì)胞黏附分子，廣泛表達于上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面，與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷徙、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。但是目前尚沒有研究確定宮頸癌干細(xì)胞表面特異性表達分子。前期有研究通過蛋白組學(xué)技術(shù)分析認(rèn)為CDC50A可能是某些CSCs表面標(biāo)記分子，基于此前提，筆者旨在通過本項研究檢測宮頸癌干細(xì)胞表面是否高表達CDC50A。

有研究顯示，宮頸儲備細(xì)胞有腫瘤干細(xì)胞具有類似的生物學(xué)特性，屬于干細(xì)胞范疇的一種幼稚多潛能細(xì)胞，具有雙向分化潛力[14]。頸管柱狀上皮下的儲備細(xì)胞增生和多潛能分化特性是造成宮頸上皮復(fù)雜的結(jié)構(gòu)改建和病理變化的基礎(chǔ)，也是造成宮頸癌變的病理基礎(chǔ)[14]。因此，宮頸儲備細(xì)胞被認(rèn)為是宮頸癌細(xì)胞的起源[15]。宮頸癌干細(xì)胞的分離和鑒定周期較長，本項研究中，筆者首先制備宮頸癌組織原代細(xì)胞，待細(xì)胞球大量增加后，加入淋巴細(xì)胞分離液，去除碎屑雜志。7d后，有部分細(xì)胞呈貼壁生長。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)篩選后，發(fā)現(xiàn)宮頸癌原代細(xì)胞中有少部分CDC50A+Lin-細(xì)胞，而正常宮頸原代培養(yǎng)細(xì)胞中幾乎未見CDC50A+Lin-細(xì)胞。這表明CDC50A可能是宮頸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。為了證實此項推論，筆者進一步通過免疫組織化學(xué)染色法檢測宮頸癌組織和正常宮頸黏膜組織CDC50A陽性表達情況，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中CDC50A陽性表達率為87.5%，明顯高于正常宮頸黏膜組織。

腫瘤干細(xì)胞的鑒定主要是需要證明它具有干細(xì)胞的自我更新、無限增殖及多向分化能力，最重要的是，它是唯一能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的細(xì)胞。因此，筆者首先經(jīng)MTT法證實了CDC50A+Lin-細(xì)胞體外增殖活性明顯高于CDC50A-Lin-細(xì)胞。并通過接種至裸鼠雙腋下皮下后，觀察腫瘤形成情況，細(xì)胞數(shù)量為1×105～1×107個/ml時，裸鼠皮下接種CDC50A+Lin-細(xì)胞，2周就可觀察到明顯的新生腫瘤塊，成瘤率明顯高于接種對照組細(xì)；而接種CDC50A-Lin-細(xì)胞的裸鼠，觀察至12周，仍未見裸鼠形成移植瘤。從而證明了CDC50A+Lin-細(xì)胞的成瘤能力。

除此以外，筆者通過TRAP法進一步分析了CDC50A+Lin-細(xì)胞和CDC50A-Lin-細(xì)胞端粒酶活性。結(jié)果顯示，CDC50A+Lin-細(xì)胞端粒酶相對表達強度顯著高于對照組細(xì)胞和CDC50A-Lin-細(xì)胞。端粒酶是由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)和端粒酶RNA組成的具有特殊逆轉(zhuǎn)錄活性的核糖核蛋白復(fù)合物，其中TERT是端粒酶的催化亞基，只表達于端粒酶陽性細(xì)胞中，而端粒酶的陽性表達與癌變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CDC50A+Lin-細(xì)胞端粒酶呈高表達，提示，胰腺癌干細(xì)胞具有端粒酶活性，它可能通過維持端粒的長度，使細(xì)胞保持體外長期傳代、自我更新的生物學(xué)特性。

目前，關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的研究在多重實體瘤領(lǐng)域已經(jīng)取得了較大的進展，但是宮頸癌干細(xì)胞的分離和鑒定研究尚少，尤其是干細(xì)胞表面標(biāo)志物尚不明確，因此需要借助其他腫瘤干細(xì)胞的研究成果和技術(shù)，本項研究采用CDC50A作為宮頸癌干細(xì)胞篩選分子也是借鑒以往的文獻報道。通過本項研究對宮頸癌原代細(xì)胞分離培養(yǎng)以及表面分子標(biāo)志物的探索，希望為后續(xù)宮頸癌干細(xì)胞的研究提供一定的經(jīng)驗和理論支持。