miR-26a調控PTEN基因降低小鼠慢性淋巴白血病細胞的耐藥性

毛洪賓，何 明

(1.開封市人民醫院 臨床藥學科，河南 開封 475000； 2.河南大學第一附屬醫院 臨床藥學科，河南 開封 475001)

慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是臨床常見的一種白血病，以外周血淋巴細胞增高及骨髓成熟淋巴細胞浸潤為主要特征[1]。患者在化療過程中對藥物的敏感性降低，繼而產生耐藥性，如何避免耐藥現象出現是治療CLL的關鍵[2]。微小RNA(microRNA)參與多種生理病理過程，與腫瘤細胞的化療敏感性和耐藥性有關，miR-26a能夠調節化療藥物的敏感性[3]。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種抑癌基因，其表達降低是腎癌預后不良的有效指標[4]。PTEN參與CLL細胞對氟達拉濱耐藥，且miR-26a可通過調節PTEN表達參與腫瘤細胞生理病理過程，但兩者在CLL耐藥性中報道較少[5]。本研究通過觀察miR-26a調控PTEN對小鼠L1210細胞系和小鼠耐順鉑(cisplatin，DDP)L1210/DDP細胞亞系耐藥性的影響，探討其可能作用機制，旨在為臨床治療CLL提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：小鼠淋巴細胞白血病L1210細胞系(中國科學院上海細胞庫)。小鼠耐DDP淋巴細胞白血病L1210/DDP細胞亞系(上海奧陸生物科技有限公司)。

1.1.2 藥物、主要試劑：注射用DDP(山東齊魯制藥廠)；DMEM培養基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；MTT試劑(Sigma Aldrich公司)；pcDNA-miR-26a-inhibitor質粒、pcDNA-miR-26a-inhibitor-NC質粒(廣州銳博生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑(Invitrogen公司)；野生型和突變型PTEN重組質粒(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗小鼠PTEN、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase，AKT)多抗、p-AKT多抗和山羊抗兔IgG-HRP(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及分組處理：將L1210細胞接種于質量分數10% FBS及1%青鏈霉素的DMEM培養基，于體積分數5% CO2培養箱內37 ℃常規培養；L1210/DDP細胞接種于DDP終濃度為0.1 mg/L的DMEM培養基，實驗前1周撤藥，取對數增殖期細胞用于后續實驗。

將細胞分為對照組(L1210細胞)、耐藥組(L1210/DDP細胞)、NC組(pcDNA-miR-26a-inhibits-NC質粒+L1210/DDP細胞)和抑制劑組(pcDNA-miR-26a-inhibits質粒+L1210/DDP細胞)。按照LipofectamineTM2000說明書將其進行轉染，繼續培養24 h。

1.2.2 RT-qPCR檢測細胞中miR-26a、PTEN mRNA表達量：取穩定轉染的各組細胞，提取總RNA，反轉錄cDNA，進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環。miR-26a上游引物：5′-AATC GAATTCGCTGAGTCAGA-3′；下游引物：5′-CATAAG GCGTCGAGTGCAACC-3′。U6上游引物：5′-ACTG CATGCCATTGCAGTC-3′；下游引物：5′-ACCGTG AACTTGCCTGCAA-3′。PTEN上游引物：5′-AGGT TCAGCTAGCTATGGCA-3′；下游引物：5′-CAGCCTA AACTGCTAGCTAA-3′。β-actin上游引物：5′-AGC AGCAGTTATACTAGCA-3′；下游引物：ACTAGCTAG CATCATGCAA-3′。miR-26a以U6為內參，PTEN以β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算miR-26a、PTEN mRNA表達水平。

1.2.3 miR-26a與PTEN靶向性的檢測：預測miR-26a 3′UTR與PTEN之間的結合位點，分別構建野生型重組質粒pMir-PTEN-WT和突變型重組質粒pMir-PTEN-MUT，分為野生型NC組、野生型+miR-26a組、突變型NC組、突變型+miR-26a組，利用LipofectamineTM2000將miR-26a-mimics/miR-26a-mimics-NC與pMir-PTEN-MT/pMir-PTEN-MUT質粒共轉染L1210細胞，按試劑盒說明書操作，計算相對熒光素酶活性。

1.2.4 耐藥性的檢測：取穩定轉染的各組細胞，接種于96孔板，待細胞匯合至70%左右時，加入含DDP(0.02、0.2、2、20和200 g/mL)的DMEM培養基，48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)溶液20 μL，繼續培養2 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL/孔，充分振蕩10 min，用酶標儀測定490 nm波長處吸光度(A)值，計算細胞抑制率，細胞抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，繪制細胞抑制率曲線，根據曲線擬合方程求出L1210細胞、L1210/DDP細胞對DDP的半數抑制濃度(half maximal inhi-bitory concentration，IC50)。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率：取穩定轉染的各組細胞，PBS洗滌，2 500 r/min離心5 min，結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻，4 ℃避光孵育15 min，10 μL PI染色5 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 Wetern blot檢測細胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白相對表達量：取穩定轉染的各組細胞，加入RIPA 裂解液裂解細胞，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性，進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST溶液洗膜，分別加入1∶1 000稀釋的PTEN、PI3K、AKT、p-AKT和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗滌后加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，加入ECL化學發光試劑，顯影、定影、拍照，分析各目標蛋白條帶吸光度值，以目的蛋白條帶吸光度值與內參β-actin條帶吸光度值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞耐藥對miR-216、PTEN mRNA表達的影響

L1210/DDP細胞中miR-26a mRNA表達明顯降低，PTEN mRNA表達明顯升高(P<0.05)(表1)。

表1 細胞耐藥對miR-26a、PTEN mRNA表達的影響

2.2 轉染miR-26a對miR-26a、PTEN mRNA表達的影響

與NC組比較，耐藥組、抑制劑組miR-26a mRNA表達降低，PTEN mRNA表達升高，且抑制劑組miR-26a mRNA表達低于耐藥組，PTEN mRNA表達高于耐藥組(P<0.05)(表2)。

表2 轉染miR-26a對miR-26a、PTEN mRNA表達的影響

2.3 miR-26a靶基因驗證

生物信息預測顯示，miR-26a與PTEN存在連續結合位點(圖1)。

野生型NC組、野生型+miR-26a組、突變型NC組、突變型+miR-26a組相對熒光素酶活性分別為：(1.31±0.15)、(0.73±0.08)、(1.29±0.14)和(1.32±0.13)。與野生型+miR-26a組比較，野生型NC組、突變型NC組、突變型+miR-26a組相對熒光素酶活性顯著升高(P<0.05)。野生型NC組、突變型NC組、突變型+miR-21組相對熒光素酶活性無差異(圖1)。

圖1 miR-26a與PTEN的結合位點Fig 1 Binding site of miR-26a and PTEN

2.4 細胞抑制率及對DDP的IC50值比較

不同濃度DDP處理細胞后，耐藥組細胞抑制率降低，抑制組細胞抑制率升高(P<0.05)(圖2)。

圖2 細胞抑制率比較Fig 2 Comparison of cytostatic rate

對照組、NC組、耐藥組、抑制組細胞對DDP的IC50值分別為：(1.12±0.13)g/mL、(1.07±0.12)g/mL、(6.35±0.65)g/mL和(0.16±0.02)g/mL。與對照組、NC組比較，耐藥組細胞IC50值升高，抑制組細胞IC50值降低(P<0.05)；且抑制組細胞IC50值低于耐藥組(P<0.05)。對照組和NC組細胞IC50值無差異。

2.5 細胞凋亡率比較

對照組、NC組、耐藥組、抑制組細胞凋亡率分別為：(66.28±6.79)%、(64.68±6.64)%、(8.57±1.13)%和(84.26±8.45)%。與對照組、NC組比較，耐藥組細胞凋亡率降低，抑制組細胞凋亡率升高(P<0.05)，耐藥組細胞凋亡率低于抑制組(P<0.05)。

對照組、NC組細胞凋亡無差異(圖3)。

2.6 細胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白水平比較

與對照組、NC組比較，耐藥組、抑制組PTEN蛋白表達升高，PI3K蛋白表達及p-AKT/AKT降低(P<0.05)；抑制組較耐藥組PTEN蛋白表達升高，PI3K蛋白表達及p-AKT/AKT降低(P<0.05)(表3，圖4)。

表3 蛋白表達水平比較

A.control group; B.NC group; C.resistance group; D.inhibitior group圖3 細胞凋亡率比較Fig 3 Comparison of apoptosis rates

A.control group; B.NC group; C.resistancegroup; D.inhibitior group圖4 細胞中各蛋白表達Fig 4 Expression of various proteins in cells

3 討論

miRNA與血液腫瘤耐藥性關系密切，其通過調控靶基因表達，抑制或激活下游信號通路，導致腫瘤細胞對藥物的敏感度發生改變，引起腫瘤細胞多藥耐藥，造成化療效果不佳甚至失敗。

miR-26a通過調節靶蛋白表達，導致乳腺癌及非小細胞肺癌細胞對藥物的敏感性，影響化療效果[6-7]。本研究中耐藥組細胞miR-26a mRNA表達較高，細胞抑制率和凋亡率較低，對DDP的IC50值維持在較高水平，抑制miR-26a表達后，細胞抑制率和凋亡率明顯升高，對DDP的IC50值明顯降低，提示過表達miR-26a可增強L1210/DDP細胞對DDP的耐藥性。PTEN是體內重要的抑癌因子，具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶雙重活性，在多種腫瘤中表現缺失或低表達，參與腫瘤發生發展過程[8]。PTEN可以作為miRNA的靶基因，參與人肺腺癌及非小細胞肺癌細胞對化療藥物的耐藥性[9-10]。本研究抑制組細胞中PTEN表達較耐藥組明顯升高，熒光素酶報告結果證實miR-26a與PTEN存在靶向性，提示抑制miR-26a可通過靶向上調PTEN，降低L1210/DDP細胞對DDP的耐藥性。

PI3K/Akt信號通路是腫瘤發生發展過程中的重要信號通路，在許多腫瘤組織中過度表達和活化，通過翻譯或轉錄水平引起腫瘤細胞失控性增殖，或下調腫瘤抑制蛋白p53的表達，還可抑制細胞凋亡進程參與腫瘤發生發展過程。PI3K/Akt信號通路與腫瘤耐藥關系密切，過度活化的AKT通過抑制凋亡信號激酶活性導致腫瘤細胞產生耐藥，與DDP、阿霉素多種化療藥物耐藥有關，嚴重影響化療效果，抑制PI3K/Akt通路可以逆轉腫瘤細胞耐藥[11]。PTEN是PI3K/Akt通路的主要抑制分子，通過PI3K抑制下游AKT活化。抑制PTEN表達可以激活PI3K/Akt信號通路，介導乳腺癌細胞的耐藥性[12]。過表達PTEN通過抑制PI3K/Akt通路，增強胃腸道間質瘤細胞的化學敏感性[13]。本研究抑制組PTEN蛋白顯著升高，PI3K、p-Akt蛋白水平顯著降低，提示上調PTEN可以抑制PI3K/Akt通路，miR-26a通過靶向調節PTEN表達，進而影響PI3K/Akt信號通路激活，從而使L1210/DDP細胞耐藥性發生改變。

綜上所述，L1210/DDP細胞中過表達miR-26a通過靶向抑制PTEN，激活PI3K/Akt信號通路，提高細胞對DDP的耐藥性，抑制miR-26a表達可以降低細胞耐藥性，體內實驗尚需進一步研究探討，以期為臨床治療CLL提供參考。