DFG-STYK1/NOK對小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3增殖以及細胞周期G1/S的影響

陳建苗

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 病原生物學系, 北京 100005)

受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)是一種對細胞增殖、分化、細胞周期、胚胎形成、血管生成和新陳代謝等細胞活動的進行具有重要意義的蛋白酶[1-2]。因此,RTKs表達異常會引起多種疾病和腫瘤[3-4]。RTKs胞外區與配體結合，激活RTKs胞內區的激酶活性，使含有Src同源區2(Src homology 2，SH2)和磷酸酪氨酸結合區(phosphotyrosine binding，PTB)結構域的蛋白與胞內區段結合被激活蛋白酶活性[1]。NOK(the novel oncog-ene with kinase-domain,NOK)是一種新型受體酪氨酸激酶。研究發現 NOK具有致癌作用[5]。對多種腫瘤的發生發展以及預后具有重要意義[6-8]。Asp-Phe-Gly(DFG)基序位于激酶活性中心活化環的起始部位，由天冬氨酸殘基、苯丙氨酸殘基和甘氨酸殘基3個氨基酸殘基組成，對調節激酶活性具有重要意義[9-11]。然而，研究發現，NOK激酶中沒有此結構。于是，本研究擬通過同源配對定點加入DFG基序，以探究DFG-NOK對NIH3T3細胞增殖和細胞周期G1/S的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)；新生牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；DMEM培養基(Gibco公司)；Neofect 轉染試劑(北京碼因科技有限公司)；MTT試劑(Sigma公司)；CCK8試劑(MedChenExpress公司)；Western blot相關試劑和PI染料(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；PCR引物、pcDNA3.0-DFG-NOK的構建及測序(上海生工公司)；感受態大腸桿菌(天根生化科技有限公司)；限制性內切酶和定點突變試劑盒(TaKaRa公司)；抗β-actin和NOK抗體(Proteintech公司)；抗Akt、p-Akt、 Erk、p-Erk和cyclin D1抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；抗STAT1抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；抗p-STAT1抗體(Bioworld公司)；抗STAT3和p-STAT3抗體(Cell Signaling公司)；抗JAK3和p-JAK3抗體(Anbo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養與轉染：將NIH3T3細胞置于含有10%新生牛血清DMEM的50 mm培養皿中，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養，3 d傳代1次。貼壁細胞達到90%匯合后，接種到30 mm培養皿中，24 h后換液。用Neofect高效轉染試劑順時轉染NIH3T3細胞，分別轉入pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK和pcDNA3.0-DFG-NOK,轉染6 h后換液，48 h后收細胞。

1.2.2 定點突變：突變使用定點突變試劑盒，按說明書操作。

1.2.3 質粒的構建：NOK激酶cDNA全長和HA(人流感病毒血凝素)標簽蛋白融合，插入到pcDNA3.0載體的HindⅢ和XbaⅠ位點形成pcDNA-NOK質粒；DFG-NOK和FLAG標簽蛋白融合，插入到pcDNA3.0載體的HindⅢ和NotⅠ位點形成pcDNA3.0-DFG-NOK質粒。pcDNA-DFG-NOK質粒的上游引物5′-ATAAGCTTATGGGCATGACACGGATG CT-3′，下游引物5′-ATGCGGCCGCTCACTTATCGT CGTCATCCTTGTAATCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′。PCR反應擴增30個循環，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。擴增產物經雙酶切再亞克隆進pcDNA3.0載體，在感受態大腸桿菌中轉化克隆，提取質粒并對擴增片段進行測序分析。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達：收集細胞，裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min收取蛋白，BCA工作液紫外分光光度計檢測蛋白樣品濃度，每孔蛋白上樣量15 μg，100 ℃沸水浴5 min。12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，一抗按比例用0.5%牛奶稀釋后4 ℃孵育過夜，用1×TBST洗4次，每次5 min，37 ℃孵育二抗1 h，清洗，ECL發光液反應，暗室曝光。

1.2.5 CCK8法檢測增殖：12孔板培養NIH3T3細胞，轉染pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK或pcDNA3.0-DFG-NOK，再將細胞鋪置96孔板，培養48 h后，每孔加5 μL CCK8溶液，孵育1～2 h，酶標儀測定450 nm吸光度值；MTT法：12孔板培養NIH3T3細胞，轉染pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK或pcDNA3.0-DFG-NOK，再將細胞鋪置96孔板，培養48 h后，每孔加10 μL MTT溶液，孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO,在37 ℃搖床上振蕩10 min，測定490 nm處吸光度(A)值。

1.2.6 Accuri C6流式檢測細胞周期：收集2×106個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加1 mL預冷的1×PBS重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入0.3 mL預冷1×PBS，再逐滴加入3倍體積的4 ℃預冷的無水乙醇，輕輕振蕩成單細胞懸液；-20 ℃固定1 h以上；4 000 r/min離心5 min去乙醇，PBS洗兩遍，加100 μL 1×PBS重懸，加100 μL PI染色液避光染色10 min；流式細胞儀檢測，保存為FCS文件格式，使用Modfit軟件分析細胞周期分布。

1.2.7 同源比對：SWISS MODEL是一種同源建模服務器，根據NOK氨基酸序列同源構建蛋白三級結構，NOK的同源模板為成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)，以FGFR1內DFG基序的位置，確定在NOK加入DFG基序的位置。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DFG基序加入NOK的位置

根據其DFG基序位置確定NOK中DFG基序位置(圖1)。將第269、270位G、L改為D、F，和第271位氨基酸組成DFG基序，對應于NOK cDNA第806、807、810位核苷酸G、A、A突變為A、C、T。

2.2 DFG-NOK對NIH3T3細胞增殖的影響

與瞬時轉染pcDNA3.0組相比，瞬時轉染pcDNA3.0-DFG-NOK的NIH3T3細胞組吸光度降低，增殖受到抑制(圖2A,B)(P<0.05)。

2.3 DFG-NOK對NIH3T3細胞周期G1/S期的影響

與轉染pcDNA3.0組相比，轉染pcDNA3.0-DFG-NOK組，G1期所占比例升高，S期所占比例降低。DFG-NOK抑制細胞周期G1期進入S期(圖3)(P<0.05)。

2.4 DFG-NOK對細胞信號通路和周期蛋白表達的影響

與轉染pcDNA3.0組相比，轉染pcDNA3.0-DFG-NOK組Erk、STAT1、STAT3和JAK3蛋白的磷酸化水平(圖4A～C,E～H) 以及細胞周期蛋白cyclinD1表達水平均降低(圖4D, I)。

3 討論

NOK是一種新型受體酪氨酸激酶，包含422個氨基酸，鑲嵌在細胞膜上，具有完整的胞內區、跨膜區和遠小于其他受體酪氨酸激酶胞外區段的胞外區[5]，它參與多種信號通路的激活，比如RAS-MAPK、PI3K-AKT和JAK-STAT等信號通路[12]。NOK在不同物種或組織器官中異常表達，人體內前列腺中的NOK表達量最高，小鼠體內小腸和結腸中表達量最高。293T和HeLa等細胞系中的NOK表達高于其他細胞系[5]。NOK在膠質瘤和鼻咽癌中激活PI3K-AKT信號通路[7-8]。此外，NOK對細胞周期也有重要作用，研究證明NOK可促進293T cyclin D1表達和細胞周期G1期進入S期[13]。

DFG分為兩種構像DFG-in和DFG-on，存在于Src和P38等激酶中，對激酶活性起到重要作用[9-11]。比對NOK氨基酸序列發現其沒有DFG基序。至今沒有關于DFG基序和NOK激酶相關聯的研究。基于以上科研背景，展開此項關于DFG-NOK的研究。

本研究選擇NIH3T3細胞為研究對象，展開DFG-NOK對細胞信號通路、細胞周期及細胞增殖影響的研究。實驗發現，NOK加入DFG基序后抑制增殖信號通路Erk、STAT3、JAK3的磷酸化和周期蛋白cyclin D1的表達；同時，也抑制NIH3T3細胞增殖和細胞周期由G1期進入S期。因此，推論NIH3T3細胞增殖的抑制可能是由于p-Erk、p-STAT3和p-JAK3表達下降引起的；細胞周期G1期進入S期阻滯可能是周期蛋白cyclin D1表達水平下降引起的，而G1期進入S期的抑制也引起細胞增殖的抑制。STAT1是細胞凋亡相關信號通路，對于結果中pcDNA3.0-DFG-NOK抑制p-STAT1表達原因還不清楚，需進一步對NIH3T3細胞進行凋亡檢測。DFG-NOK中GLG突變為DFG,甘氨酸突變為天冬氨酸，非極性氨基酸變為酸性氨基酸，亮氨酸突變為苯丙氨酸，非極性氨基酸變為芳香族氨基酸，氨基酸性質的改變，致使各氨基酸殘基之間的空間構象和相互作用力改變。

A.Accuri C6 result of NIH3T3 transiently transfected pcDNA3.0；B.Accuri C6 result of NIH3T3 transiently transfected pcDNA3.0-DFG-NOK；C.statistics analysis of the G1/S phase distribution; *P<0.05 compared with pcDNA3.0

A.changes of Akt,p-Akt、Erk,p-Erk protein expression in responding to DFG-NOK over expression； B.changes of STAT1,p-STAT1,STAT3,p-STAT3 protein expression in responding to DFG-OK over expression；C.changes of JAK3,p-JAK3 protein expression in responding to DFG-NOK over expression；D.changes of cyclinD1 protein expression in responding to DFG-NOK over expression；E.gray-scale value of p-Erk in responding to DFG-NOK over expression；F.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression；G.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； H.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； I.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with pcDNA3.0 group； #P<0.05 compared with pcDNA3.0-NOK group

本工作雖然證實DFG-NOK抑制NIH3T3細胞增殖和細胞周期G1期進入S期。但對于DFG-NOK的結構和引起這些作用的機制還未明確，需做進一步研究。