依托咪酯上調miR-290-5p減輕LPS誘導的大鼠心肌細胞系H9C2損傷

雷家秀，朱雅萍，張 雨

(鄭州市第七人民醫院 麻醉科，河南 鄭州 450000)

膿毒癥(sepsis)是一種由感染引起的全身性炎性反應綜合征，可導致多器官功能障礙，尤其是心血管系統。常常導致心肌受損、收縮力減弱和心舒張功能障礙，嚴重影響心臟功能。目前尚無有效的治療方法。依托咪酯(etomidate，Eto)是咪唑類衍生物，由于其起效快、安全性高、對心血管和呼吸系統影響輕微等優點，是臨床常用的麻醉誘導劑之一。Eto具有降低機體氧化應激水平及炎性反應，對膿毒癥機體具有保護作用[1-3]。miR-290-5p是miR-290-295簇的成員之一，異丙酚通過上調膿毒癥大鼠miR-290-5p的表達減輕膿毒癥引起的急性腎損傷[4]。但Eto能否通過調控miR-290-5p表達，減輕膿毒癥心肌損傷尚未可知。本研究初步探討Eto對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的心肌細胞損傷的影響及分子機制，為防治膿毒癥心肌損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細胞系(rat myocardial cell line H9C2,H9C2)(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)；DMEM培養基、胎牛血清和青鏈霉素溶液(Hyclone公司)；脂多糖(Sigma-Aldrich公司)；依托咪酯(純度≥99.8%)(中國食品藥品檢定研究院)；四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞活力檢測試劑盒、膜聯蛋白異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑和RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)含量ELISA檢測試劑盒(R&D Systems公司)；miR-290-5p模擬物(miR-290-5p mimics)、miR-290-5p抑制物(anti-miR-290-5p)、模擬物陰性對照(miR-con)、抑制物對照(anti-miR-con)以及PCR引物(北京華大基因公司)；兔抗cleaved-caspase-3抗體、兔抗cyclinD1抗體以及山羊抗兔IgG(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的DMEM培養基培養H9C2細胞。取對數期細胞分為對照(control)組；LPS組(終濃度為1 mg/L的LPS處理H9C2細胞[5])；2 mg/L Eto+LPS組(終濃度為2 mg/L的Eto預處理H9C2后進行LPS誘導)；4 mg/L Eto+LPS組(終濃度為4 mg/L的依托咪酯預處理H9C2后進行LPS誘導)；miR-con+LPS組(轉染miR-con后進行LPS處理)；miR-290-5p+LPS組(轉染miR-290-5p mimics后進行LPS處理)；Eto+anti-miR-con+LPS組(轉染miR-con后用終濃度為4 mg/L的依托咪酯和1 mg/L的LPS處理)；Eto+anti-miR-290-5p+LPS組(轉染miR-290-5p mimics后用終濃度為4 mg/L的依托咪酯和1 mg/L的LPS處理)。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力;各組細胞進行相應處理后，按照5×103個/孔接種到96孔板，24 h后每孔加入20 μL的MTT，培養箱繼續孵育4 h，棄去上清液，加入150 μL的DMSO振蕩溶解10 min，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值。

1.2.3 流式細胞計量術檢測細胞凋亡;收集各組H9C2細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，采用1×結合緩沖液調整細胞濃度為1×105個/mL的細胞懸液。取100 μL細胞懸液加入流式管，分別加入5 μL的annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min，補加1×結合緩沖液至500 μL，立即上機檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測細胞培養液中TNF-α和IL-6含量:按照ELISA試劑盒說明書在反應孔內加入100 μL待測樣品或標準品，空白對照孔內加入100 μL的稀釋液，酶標儀檢測450 nm處的吸光度值，根據標準品計算細胞培養液中TNF-α和IL-6的含量。

1.2.5 Western blot檢測cleaved-caspase-3蛋白的表達:采用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE。當蛋白分離后，采用常規濕法轉膜將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%的脫脂牛奶中封閉1 h，PBST洗膜3 min。將膜置于稀釋的Ⅰ抗溶液中室溫孵育2 h，PBST洗膜10 min，洗3次；再將膜置于稀釋的Ⅱ抗溶液中室溫孵育1 h，PBST洗膜10 min，洗3次。化學發光顯色劑顯色后，利用ImageJ進行分析，以目的蛋白的吸光度值與內參蛋白吸光度值比值表示目標蛋白的表達水平。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-290-5p的表達水平:收集各組H9C2細胞，PBS洗滌細胞2次，Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，利用實時定量PCR儀進行擴增。引物序列如下：miR-290-5p上游引物5′-GCTGGGTTTC ACGGGGGTATCAA-3′，下游引物5′-TCAACTGAGTG CCGTAGGGTGCG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGG CAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACG AATTTGCGTGTC-3′。以U6為內源性參照，根據2-ΔΔCt法計算目的基因的表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度Eto對LPS處理的心肌細胞H9C2存活率的影響

與對照組比較，LPS組H9C2細胞存活率顯著降低；與LPS組比較，Eto+LPS組H9C2細胞存活率顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 不同濃度Eto對LPS處理的H9C2活性的影響

2.2 不同濃度Eto對LPS處理的心肌細胞H9C2凋亡和炎性因子表達水平的影響

與對照組比較，LPS組H9C2細胞cleaved-caspase-3蛋白的表達、細胞凋亡率及細胞培養液TNF-α和IL-6的含量顯著升高；與LPS組比較，Eto+LPS組H9C2細胞cleaved-caspase-3蛋白的表達、細胞凋亡率及細胞培養液TNF-α和IL-6的表達水平顯著降低(P<0.05)。選取保護作用較強的Eto濃度(4 mg/L)進行后續研究(圖1，表2)。

表2 不同濃度Eto對LPS處理的H9C2凋亡和炎性因子表達水平的影響

2.3 依托咪酯對miR-290-5p表達的影響

與NC組比較，LPS組H9C2細胞miR-290-5p的表達顯著降低；與LPS組比較，LPS+Eto組H9C2細胞miR-290-5p的表達顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 依托咪酯對miR-290-5p表達的影響

2.4 高表達miR-290-5p對LPS處理的心肌細胞H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

與NC組比較，LPS組H9C2細胞miR-290-5p和cyclinD1蛋白的表達水平顯著降低，cleaved-caspase-3蛋白的表達水平及細胞凋亡率顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞培養液中TNF-α和IL-6的含量顯著升高；與miR-con+LPS組比較，miR-290-5p+LPS組H9C2細胞miR-290-5p和cyclinD1蛋白的表達水平顯著升高，cleaved-caspase-3蛋白的表達水平及細胞凋亡率顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞培養液中TNF-α和IL-6的含量顯著降低(P<0.05)(圖2，表4)。

A.flow cytometry detected apoptosis; B.Western blot detected cleaved-caspase-3 protein expression圖1 不同濃度Eto對LPS處理的H9C2凋亡和炎性因子表達水平的影響

圖2 Western blot檢測cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白表達Fig 2 Western blot detected the expression of cyclinD1 and cleaved-caspase-3 proteins

表4 高表達miR-290-5p對LPS處理的心肌細胞H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

2.5 低表達miR-290-5p可以降低Eto對LPS處理的心肌細胞H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

與Eto+anti-miR-con+LPS組比較，Eto+anti-miR-290-5p+LPS組H9C2細胞miR-290-5p和cyclinD1蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，細胞培養液中TNF-α和IL-6的含量顯著升高(P<0.05)(圖3，表5)。

表5 低表達miR-290-5p可以降低Eto對LPS處理的H9C2增殖、凋亡和炎性因子釋放的影響

圖3 Western blot檢測cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白表達Fig 3 Western blot detected the expression of cyclin D1 and cleaved-caspase-3 proteins

3 討論

心肌損傷及由此導致的心臟功能障礙是膿毒癥最常見的并發癥。LPS又叫內毒素，是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分，可通過進入淋巴和循環系統引起全身炎性反應、內毒素血癥、感染性休克和多器官衰竭，其誘導的心肌細胞損傷是最常用的膿毒癥心肌損傷模型[5-6]。本研究發現LPS顯著降低H9C2細胞存活率，顯著增加細胞凋亡率及細胞培養液上清中TNF-α和IL-6的表達，與既往研究[7]結果基本吻合。表明心肌損傷細胞模型構建成功。

Eto是一種咪唑類靜脈麻醉藥，其對心肌細胞的存活狀態、舒張時間以及收縮幅度影響輕微，因此很快在臨床被普及[8]。Eto預處理還可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[9]、進行體外循環手術時，應用Eto進行靜脈麻醉可減輕機體的炎性反應[10]，Eto對LPS誘導的神經膠質細胞中IL-1β的分泌也有明顯抑制作用[11]。本研究發現不同濃度Eto可顯著抑制LPS誘導的促炎因子TNF-α及IL-6的分泌、減輕心肌細胞炎性反應和LPS誘導的心肌細胞凋亡，促進心肌細胞存活，提示Eto對LPS誘導的心肌細胞損傷具有保護作用。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類18～22個核苷酸的短鏈非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3′非翻譯區結合發揮翻譯調節因子作用，涉及多種種疾病，包括LPS誘導的心肌損傷[12]。LPS誘導的心肌細胞中miR-146a表達下調，過表達miR-146a提高心肌細胞抗氧化活性，抑制炎性反應和細胞凋亡，減輕LPS誘導的心肌細胞損傷[13]。在LPS誘導的膿毒癥心肌組織中miR-21-3p表達上調，抑制miR-21-3p表達可改善LPS導致的心功能下降、自噬增高、線粒體超微損傷和心肌肥大，提高小鼠生存率[14]；抑制miR-203也可減少LPS誘導的心肌細胞損傷[15]。本研究發現LPS誘導心肌細胞損傷后，miR-290-5p的表達顯著下調，而Eto可顯著增加miR-290-5p的表達水平。高表達miR-290-5p后心肌細胞存活率顯著升高，TNF-α和IL-6的分泌以及細胞凋亡率顯著降低，減輕LPS誘導的心肌細胞損傷。進一步研究發現，低表達miR-290-5p可逆轉Eto對LPS誘導的心肌細胞損傷的保護作用。提示Eto通過調控miR-290-5p表達對LPS誘導的心肌細胞損傷具有保護作用，異丙酚通過調控miR-290-5p表達減輕LPS誘導的足細胞損傷支持了本研究觀點[4]。

綜上所述，依托咪酯通過提高細胞活力、減少細胞凋亡和抑制炎性細胞因子的產生，保護H9C2細胞免受脂多糖誘導的炎性損傷，其機制與上調miR-290-5p表達有關。本結果為依托咪酯在防治膿毒癥心肌損傷中的應用提供了實驗依據。