分析鑒定胃食管交界處腺癌發(fā)生與進(jìn)展的關(guān)鍵基因

王雨芊，陳亞玫，楊 潔，林 媛，駱盈盈，張少森，吳 晨*

(1.國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室病因及癌變研究室 癌發(fā)生及預(yù)防分子機(jī)理北京市重點實驗室，北京 100021；2.北京大學(xué)北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心 生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心，北京 100871)

胃癌與食管癌在2020年全球惡性腫瘤發(fā)病率中分別排第5和第8位，全球范圍內(nèi)每年有超過130萬死亡病例。胃食管交界處腺癌(adenocar-cinoma at the gastroesophageal junction, ACGEJ)是一種位于食管與胃交界處的惡性腫瘤。雖然近40年來胃癌的發(fā)病率逐年下降[1]，ACGEJ的發(fā)病率卻仍在驚人地增加[2]。目前，ACGEJ的治療方式仍以手術(shù)為主，術(shù)后5年的生存率僅為20%～25%，低于食管癌和胃癌[3-4]。因此，全面了解ACGEJ發(fā)生和進(jìn)展過程中的分子特征，發(fā)現(xiàn)與預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物對改善患者預(yù)后十分重要。

惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要基因會影響一系列關(guān)鍵細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)，全面鑒定影響腫瘤演變的關(guān)鍵基因及其通路。能夠為建立預(yù)警、早診和指導(dǎo)靶向精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)[5]。研究人員在本研究中獲得了58例ACGEJ患者的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，鑒定出癌與癌旁組織間差異表達(dá)的關(guān)鍵基因，分析了差異基因在腫瘤進(jìn)展中的促進(jìn)作用和臨床潛在價值，將差異基因與患者預(yù)后進(jìn)行了系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)分析，鑒定出9個與預(yù)后顯著相關(guān)的關(guān)鍵基因，并結(jié)合患者臨床信息建立了nomogram生存預(yù)測模型。

1 材料與方法

1.1 研究對象及臨床資料

研究中樣本取自2016年5月至11月于河南省林州腫瘤醫(yī)院和林州食管癌醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的ACGEJ患者。共獲得58例ACGEJ患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本(距離腫瘤邊緣位置5 cm以上)，患者均未進(jìn)行手術(shù)前放射治療及化學(xué)治療。每位患者的病理資料由病案系統(tǒng)查詢獲得，臨床分期依據(jù)UICC/AJCC癌分期手冊第七版(胃癌)進(jìn)行判定，患者的總生存時間由電話隨訪收集。本研究已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會的審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：20/069-2265)，并且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序:每個樣本的病理信息由2名病理醫(yī)生評判，并保證測序的腫瘤樣本中腫瘤細(xì)胞含量>60%，壞死組織<20%，癌旁樣本不含腫瘤細(xì)胞。研究提取腫瘤與癌旁組織的RNA并于Illumina HiSeq 2000平臺上進(jìn)行雙端測序，獲得58對ACGEJ腫瘤組織與癌旁組織配對的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.2.2 差異表達(dá)基因的分析:通過HISAT2軟件將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)匹配到Ensembl GRCh37版本的人類基因組，使用StringTie軟件[6]對RNA進(jìn)行組裝，獲得具體基因的表達(dá)量，并對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換的標(biāo)準(zhǔn)化。

采用R包limma對58對腫瘤與其配對癌旁組織的RNA數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗，并采用Benjamini-Hochberg方法進(jìn)行校正分析，避免假陽性結(jié)果的發(fā)生，并以|log2fold change (FC)|>1.2且Q<0.05作為顯著差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 通路富集的分析:為計算癌與癌旁組織間通路或者特定基因集的表達(dá)活性，將顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行了基因集變化分析(gene set variation analysis，GSVA)。具體來說，研究使用R語言的GSVA包進(jìn)行計算，得到樣本間的GSVA 分?jǐn)?shù)，并用R 包limma對GSVA分?jǐn)?shù)進(jìn)行差異分析，獲得在腫瘤與癌旁組織間通路對比分?jǐn)?shù)(t值)。GSVA分析中納入的通路均來自MSigDB數(shù)據(jù)庫，包括50條Hallmark通路和代表生物學(xué)過程的基因本體論(gene ontology，GO)功能基因集。

1.2.4 生存期分析:研究基于LASSO回歸對在腫瘤組織與癌旁組織中差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選，得到與ACGEJ患者總生存相關(guān)的基因，并構(gòu)建預(yù)后相關(guān)基因集。研究使用多因素cox風(fēng)險回歸分析評估預(yù)后基因集在ACGEJ中預(yù)測總生存期(overall survival，OS)的能力，根據(jù)3年受試者操作特性曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)轉(zhuǎn)折點進(jìn)行風(fēng)險劃分，將患者劃分成高風(fēng)險(22例)和低風(fēng)險(14例)兩組，并計算ROC曲線下面積(area under curve，AUC)。通過R包survminer對兩組樣本的OS進(jìn)行Kaplan-Meier圖可視化和對數(shù)秩檢驗的差異分析。研究綜合臨床病理信息和預(yù)后相關(guān)基因集的風(fēng)險特征，使用R包rms構(gòu)建預(yù)測ACGEJ生存的nomogram[7]。為評估預(yù)測模型的預(yù)測精度，研究計算了模型的一致性指數(shù)(concordance index，c-index)，以及使用圖形校準(zhǔn)法繪制關(guān)于患者的模型預(yù)測概率與實際生存概率的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征及與預(yù)后的關(guān)系

58例ACGEJ患者年齡為42～80歲，中位年齡65歲；其中，男性44例(75.9%)，女性14例(24.1%)。這些患者中包含Ⅰ期患者6例，Ⅱ期患者10例，III期患者42例，無IV期患者。全組患者中已死亡病例15例，目前生存患者21例，失訪22例，中位隨訪時間為45個月(表1)。

表1 ACGEJ臨床特征的cox單因素回歸分析結(jié)果

2.2 ACGEJ中的失調(diào)基因

在58例ACGEJ患者腫瘤組織和癌旁組織對照HR.hazard ratio;CI.confidence interval.

中發(fā)現(xiàn)558個顯著上調(diào)表達(dá)的基因和179個顯著下調(diào)表達(dá)的基因。按照差異倍數(shù)排序，在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)前5位的關(guān)鍵基因為：CST1、INHBA、CLDN3、SPP1和SFRP4[8-12]。在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)前5位的關(guān)鍵基因為PGA5、LIPF、PGA4、CBLIF和ATP4B(圖1)。

圖1 ACGEJ中的差異表達(dá)基因Fig 1 Differentially expression genes in ACGEJ

2.3 ACGEJ失調(diào)基因顯著富集在腫瘤進(jìn)展的相關(guān)通路

與癌旁組織相比，ACGEJ腫瘤組織中蛋白質(zhì)磷酸化、mTORC1信號、G2M檢查點、紡錘體有絲分裂、KRAS相關(guān)基因激活等通路具有顯著富集。而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、KRAS相關(guān)基因抑制等通路在腫瘤組織中顯著下調(diào)(圖2)。

圖2 GSVA通路富集分析Fig 2 GSVA enrichment analysis

2.4 研究建立預(yù)測ACGEJ患者預(yù)后的生存模型

在LASSO回歸分析中，篩選出9個與ACGEJ預(yù)后顯著相關(guān)的差異表達(dá)基因：ASF1B、ACTN1、KNL1、SAPCD2、TP53I11、DMBT1、CNFN、ID2和DPT。研究將預(yù)后相關(guān)基因構(gòu)建多因素生存預(yù)測模型，該模型AUC為0.79。Kaplan-Meier 生存分析顯示低風(fēng)險組的總生存期顯著高于高風(fēng)險組(Log-rank檢驗P<0.01)(圖3)。

圖3 預(yù)后特征基因集的生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier curves of 3-year overall survival for the prognosis gene set

選取腫瘤樣本臨床病理特征中的年齡、臨床分期和預(yù)后相關(guān)基因的風(fēng)險情況建立了nomogram生存預(yù)測模型(圖4)。該nomogram圖中每個預(yù)測變量的評分相加的總分值，可以預(yù)測ACGEJ患者未來3年的生存情況。該模型的c-index為0.81，同時標(biāo)準(zhǔn)曲線圖顯示該模型的預(yù)測值與實際觀測值的吻合度較好(圖5)。

圖4 ACGEJ nomogram 3年生存預(yù)測模型Fig 4 Nomogram predicts 3-year overall survival for ACGEJ patients

圖5 ACGEJ預(yù)測模型calibration圖Fig 5 The calibration curves for predicting ACGEJ survival at 3 years

3 討論

近年來，ACGEJ的發(fā)病率在全球持續(xù)增高，尤其是在中國地區(qū)[13]，需要更多為ACGEJ的臨床靶向治療提供理論基礎(chǔ)的研究。在本研究中利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，深入挖掘了在ACGEJ與癌旁組織中差異表達(dá)的基因，并基于這些差異基因構(gòu)建了一個多基因生存預(yù)測模型。通過結(jié)合臨床特征繪制nomogram，利用這一模型可較好地預(yù)測ACGEJ患者的生存狀況，說明該模型有潛在的臨床價值。

基因表達(dá)失調(diào)是腫瘤發(fā)生中的主要標(biāo)志，研究分析轉(zhuǎn)錄組在腫瘤組織中的改變能夠為臨床治療提供更多的機(jī)會[14]，本研究獲得的在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)前5位的關(guān)鍵基因均被作為胃癌或其他腫瘤的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行過相關(guān)研究，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用等。此外，在腫瘤顯著下調(diào)的基因中，PGA5和PGA4為編碼胃蛋白酶原I(PGI)的基因，PGI的降低常作為胃癌篩查的重要指標(biāo)[15]。據(jù)此推測臨床上可參考PGI指標(biāo)輔助ACGEJ篩查與診斷。

本研究對ACGEJ的差異基因進(jìn)行了系統(tǒng)的功能富集分析，發(fā)現(xiàn)一類差異基因顯著富集在與細(xì)胞增殖相關(guān)的通路上，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，另一類差異基因富集在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)通路上，EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要過程，說明這些差異基因參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。還有一類基因富集在KRAS上調(diào)激活通路，KRAS蛋白能夠激活多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)化和存活，說明KRAS通路的激活在ACGEJ的發(fā)展過程中起到重要作用。

現(xiàn)有的研究對ACGEJ的預(yù)后分析多以單因素為主[16]，而應(yīng)用多因素分析構(gòu)建預(yù)測ACGEJ的生存模型報道較少。本研究鑒定出9個基因的表達(dá)與ACGEJ患者的預(yù)后顯著相關(guān)，這個預(yù)后相關(guān)基因集構(gòu)建的多因素生存預(yù)測模型能夠較好地對ACGEJ進(jìn)行生存預(yù)測。根據(jù)以上9個基因構(gòu)成預(yù)后相關(guān)基因集的風(fēng)險評估值并結(jié)合患者臨床特征建立的nomogram模型，可以進(jìn)一步提高預(yù)后基因集的生存預(yù)測能力，nomogram也可以轉(zhuǎn)換成易于使用的臨床檢測方法。該模型將為探索ACGEJ的預(yù)后標(biāo)志物和建立新的臨床生存預(yù)測模型提供參考。