Dicer1缺失對小鼠早期神經發育的影響

劉高澳，彭小忠,2*，舒鵬程*

(1.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系 醫學分子生物學國家重點實驗室 醫學靈長類研究中心 神經科學中心，北京 100005；2.中國醫學科學院醫學生物研究所，云南 昆明 650118)

神經發生是哺乳動物大腦神經干細胞產生功能性神經元的過程[1]，由多種信號通路、生長因子、編碼和非編碼RNA控制的。大腦皮層和海馬是形成學習與記憶等功能的關鍵腦區，其發育異常會導致智力障礙。DICER屬于RNaseIII[2]，敲除Dicer1基因后不能產生成熟microRNAs(miRNAs)[3]，在神經系統中Dicer1缺失會令小鼠出生后早期死亡[4]。miRNAs在神經干細胞中具有調節增殖、遷移、分化[5]以及調控凋亡和存活相關信號通路的作用[6]。因此，Dicer1敲除小鼠是研究miRNAs作用的必要工具鼠。D6是小鼠mDach1基因的增強子，其Cre重組酶活性主要表達在新皮層和海馬區域[7]，E10.5起始表達，E12.5時在背側皮層廣泛表達[8]。

本研究利用D6-Cre在發育早期條件性敲除Dicer1，結合RNA-seq技術，在轉錄水平上具體分析在神經干細胞中敲除Dicer1后的基因表達差異，研究miRNAs對大腦皮層早期發育的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物：SPF級Dicer1-floxed小鼠(南京大學模式動物研究所)(JAC LAB NUMBER:006001)；SPF級D6-Cre工具鼠(美國耶魯大學鐘偉民教授惠贈)。Dicer1-floxed純合型小鼠與D6-Cre進行交配進而獲得D6-Cre介導的Dicer1條件性敲除小鼠。

1.1.2 主要試劑：多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)、溴化乙啶(ethidium bromide, EB)、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidine-2-phenyl indole, DAPI)(Sigma公司)；蔗糖、蛋白酶K(Proteinase K)、Trizol(Invitrogen公司)；Anti-NeuroD2 antibody(Abcam公司)；瓊脂糖(Gibco公司)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining, HE)、辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔 IgG(中杉金橋生物公司)；二甲苯、無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；50 bp DNA Ladder(天根生化科技有限公司)；引物合成(北京擎科生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 PCR鑒定轉基因小鼠基因型:剪取對應標號的腳趾組織，加入裂解液并提取DNA組，測定濃度后，進行上樣、電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠置于Bio-Rad成像儀中曝光，并分析條帶。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

1.2.2 樣品的獲取、處理與測序：孕鼠脫頸法處死，采集E14.5小鼠大腦背側皮層組織，液氮速凍，并置-80 ℃冰箱保存待測。使用Trizol法從小鼠腦組織中提取總RNA。NanoPhotometer spectrophotometer檢測RNA純度(A260/A280在1.8～2.1，A230不低于1.7)并純化mRNA，將所得到的mRNA隨機打斷成片段，再用隨機引物和反轉錄酶合成cDNA片段，再對cDNA片段進行末端修復，并連接測序接頭，富集純化的cDNA模板后用Agilent 2100 bioanalyzer自動化電泳分析，對文庫進行質檢，最后上機測序。制備的RNA樣品委托諾禾致源生物信息科技有限公司進行分析。使用DESeq2軟件(1.16.1)進行兩個比較組合之間的差異表達分析。通過 clusterProfiler R軟件實現差異表達基因的GO富集分析。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色檢查 D6-Cre-Dicer1條件性敲除小鼠表型：用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定腦組織標本，OCT包埋，切片，經HE染色后，在顯微鏡下觀察腦組織整體形態變化。

1.2.4 免疫熒光檢測D6-Cre-Dicer1條件性敲除小鼠表型：切片從-80 ℃冰箱取出，在室溫放置10～15 min使之恢復至室溫。同時，打開烘箱，調至50 ℃預熱，烘烤15 min；浸入1×PBS中5 min，兩次。以0.3% Triton-X100-PBS配制5%綿羊血清封閉液，封閉組織45 min。將一抗按照說明書比例稀釋至0.3% Triton-X100-PBS中，一抗孵育組織4 ℃過夜。第2天，放置1×PBS中5 min，兩次洗片后，加入二抗稀釋液，置于濕盒內，放在室溫下避光2～3 h。避光洗片后，在其上滴加含DAPI的熒光封片劑進行封片。使用激光共聚焦顯微鏡(Olympus，FV-1000)進行免疫熒光結果拍照，使用Photoshop CS6對圖像進行裁剪，使用Adobe illustrator CS6進行圖像編排與繪圖。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Dicer1條件敲除小鼠的獲得和表型分析

Dicer1-floxed小鼠根據敲除策略(圖1A)以PCR鑒定小鼠基因型，Dicer1突變純合型條帶大小為420 bp，Cre條帶大小為481 bp，D6-Cre-Dicer1小鼠構建成功(圖1B)。

初步觀察，Dicer1條件性敲除小鼠出生1個月左右，較野生型相比，體型瘦弱，行動遲緩運動無力。爬行緩慢，且對應激不敏感。分離出生后28 d的Dicer1條件敲除小鼠大腦組織，與野生型相比，敲除組大腦組織體積明顯變小(圖1C)，質地較軟，結構不清，邊緣模糊。出生后3 d小鼠腦組織切片HE染色，與對照組比，敲除組大腦皮質明顯變薄，海馬變小且結構部分缺失。免疫熒光(immunofluorescence，IF)染色檢測神經元情況(NeuroD2，神經元標志物)，敲除組小鼠大腦皮質中NeuroD2+細胞減少且分布異常(圖1D)。因此，D6-Cre介導的Dicer1條件性敲除，導致皮質神經元發育異常。

A.knockout strategy for Dicer1; B.genotype was identified by PCR; C.ablation of Dicer1 by D6-Cre seriously affects telencephalon structure(n≥3); D.HE staining to detect the tissue structure and morphology, hippocampus was smaller than controls; IF staining was used to detect neuronal dysplasia, neurons were greatly reduced(n≥3)

2.2 D6-Cre介導的Dicer1 cKO對神經干細胞干性的影響

提取E14.5小鼠背側端腦組織總 RNA，利用RNA-seq對Dicer1敲除前后進行差異基因篩選(P<0.05)。與對照組相比，條件敲除組中Dicer1明顯下調(P<0.01)。篩選得到差異表達基因45個，上調基因11個，下調基因34個(圖2A)。

檢測干細胞相關表型基因(Sox9、Id3、Aldoc、Clu、Sox2、Prom1、Ntm、Gja1、Atp1a2、Cenpf、Cdk1、Apoe、Pax6)，實驗組神經干細胞中高表達的Sox2、Pax6等基因無明顯表達差異，其他在干細胞中高表達的基因在Dicer1敲除前后也無明顯改變(圖2B)。大腦皮層特異層次表達的標志物中，Cux1、Cux2、Brn2、Satb2在Dicer1敲除前后表達下調(P<0.05)，Er81、Rorb、Tle4、Sox5在Dicer1敲除前后表達量無明顯改變(圖2C)。E14.5腦組織免疫熒光染色，Pax6+的放射狀膠質細胞數量在神經元發生時期尚未見明顯改變(n≥3)(圖2D)，Dicer1 cKO小鼠中神經元的減少并不是由于神經前體細胞的減少引起的。

2.3 D6-Cre-Dicer1 cKO主要影響的信號通路

GO功能富集分析，圖3顯示了部分差異表達基因參與的生物學過程、分子功能、細胞成分富集結果。Dicer1條件性敲除前后主要受影響的信號通路為NF-κB信號通路、Wnt信號通路、MAPK-ERK信號通路和JAK-STAT信號通路等。Dicer1敲除后，可誘發DNA損傷和相關通路的應激。

圖3 差異表達基因GO 分析圖Fig 3 GO term of the differentially expressed genes

2.4 Dicer1 cKO 對神經干細胞中lncRNA Xist表達的影響

RNA-seq測序差異表達倍數前10的下調基因如表2，Xist的表達在Dicer1敲除后大量減少(P<0.001)。Xist是雌性X染色體失活必須的，經檢測Dicer1敲除后位于X染色體上的Acsl4、Clcn5、Brwd5、Chic1、Vma21、Magt1、Phf6、Zfp275基因表達量上調(P<0.05)(圖4A)。Dmrta2、Dmrt3、Sox3、Sox9、Sox17、Sox21、Sox30等個體性別發育相關基因，在Dicer1敲除前后表達量無明顯差異(圖4B)。Dicer1敲除不影響常染色體Suz12和Ezh2編碼產物表達量(圖4C)。

表2 Dicer1條件性敲除后差異表達前10的基因

3 討論

70%的miRNAs在哺乳動物的大腦中表達[9]，而且許多miRNAs的表達水平在大腦發育過程中都發生了變化[10]，本實驗通過HE染色和免疫熒光染色發現，D6-Cre介導的Dicer1的特異性敲除會導致出生后的小鼠大腦皮層發育異常，提示miRNAs可能在此過程中發揮重要調節作用。轉錄組學結合系統生物信息學在全基因組水平分析Dicer1條件性敲除前后的基因表達差異。Dicer1特異性敲除前后，干性相關基因表達量無明顯差異，特定皮層標志物Cux1、Cux2、Brn2、Satb2表達量明顯下調(P<0.05)。與此前報道的，miRNAs對干細胞自我更新是非必須的，對新皮層中指定皮層的命運決定是必不可少的[11]結果相一致。

A.the differences in genes between the control group and Dicer1 cKO group were mapped to the volcano chart(P<0.05); B.statistical comparison the expression of neural stem cell markers; C.statistical comparison the marker expressed in specific layers of cerebral cortex; D.IF staining detected the expression differences of Pax6 in cerebral cortex of E14.5 mice(n≥3)

信號通路可被miRNAs靶向調節，實現通路之間的cross-talk。Dicer1敲除后主要受影響的信號通路為NF-κB信號通路、Wnt信號通路、MAPK-ERK信號通路和JAK-STAT信號通路。且神經發生早期Dicer1敲除，引發DNA損傷相關通路的應激。lncRNA Xist在雌性哺乳類X染色質沉默中發揮作用，是X染色體去活化的主要影響因子[12]。lncRNA Xist被DICER加工后可發揮生物學作用[13]，Dicer1缺失的情況下，lncRNA Xist穩定性受影響[14]。轉錄組分析得到Dicer1敲除lncRNA Xist表達大量減少后，X染色體上Acsl4、Clcn5、Brwd5、Chic1等基因表達上調，X染色質沉默輔助多梳蛋白Suz12和Ezh2表達量無明顯差異，結果與在胚胎干細胞(ES)中的檢測結果一致[14]。此外，性別決定相關基因無明顯表達差異，Dicer1對lncRNA Xist的調節作用與性別無關。在神經發生早期lncRNA Xist對神經干細胞的調節作用還需進一步探索。

A.genes expression on X chromosome were increased after Dicer1 cKO(P<0.05); B.influenced on sex-determined genes expression in Dicer1 cKO; C.red arrows showed increased significantly compared with Ctrl group(P<0.05); blue arrow showed decreased significantly compared with Ctrl group(P<0.05); black arrows showed no significantly difference compared with Ctrl group

綜上所述，本研究利用Dicer1條件敲除鼠研究miRNAs對大腦皮層早期發育的調控作用。結果表明，miRNAs對于干細胞干性維持非必須，但參與指定皮層的命運決定過程。Dicer1的缺失將導致lncRNA Xist表達水平的下調，且其中的調控機制與性別無關。