hnRNPA3通過影響mRNA出核調控hESCs多能性

楊嘉賓，陳仲揚，周凡琦，余 佳，馬艷妮

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系醫學分子生物學國家重點實驗室 北京 100005)

人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)是研究早期胚胎發育的細胞模型。hESCs從囊胚期的內細胞團分離而來，在體外可無限增殖并可分化成各種不同類型的體細胞[1]，因而具有極其重要的研究和臨床應用價值。hESCs中基因表達調控在多層次之間存在復雜相互作用，其自我更新調控機制在轉錄水平得到了廣泛而復雜的描述[2]，但是缺乏對RNA運輸等轉錄后水平的了解。

真核生物在進化上區別于原核生物的特點之一是有核膜包被的細胞核，因此mRNA運輸是調節哺乳動物基因表達途徑中潛在的重要節點。多種生物過程包括DNA修復、基因表達、應激反應、細胞增殖、細胞存活和造血細胞分化都可以通過mRNA的選擇性出核來調控[3]。在經典的mRNA運輸途徑中，mRNA加工完成后會募集出核相關蛋白，形成具有出核能力的mRNP，與核孔蛋白進行對接，交換信息后通過核孔進入到細胞質中，進一步運輸到翻譯機器上進行翻譯，在這個過程中，核孔作為看門人發揮著重要作用[4]。

RNA結合蛋白異質核核糖核蛋白A3(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3，hnRNPA3)在調節RNA的胞質運輸方面發揮著非常重要的作用[5]。本研究旨在探究hnRNPA3在hESCs維持自我更新中的生物學功能，探討其在RNA運輸過程中的新機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞: hESCs為H1細胞系(中國醫學科學院血液學研究所贈送)。

1.1.2 主要試劑: Matrigel(Corning公司)；mTESR1、ReLeSR和Accutase(Stem Cell公司)；NPC抗體(Abcam公司)；protein A磁珠、核質分離試劑盒(Thermo Fisher Scientificals公司)；RT-qPCR試劑(TaKaRa公司)；構建質粒所需的內切酶(NEB公司)；Mouse IgG 抗體、AP染色試劑盒(Millipore公司)；Trizol、M-MLV反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)；NPC抗體(Abcam公司)；抗Nup62抗體、抗Nup88抗體、抗HSP90抗體、抗fibrillin抗體、抗tubulin抗體、抗-laminB抗體和抗hnRNPA3抗體(Proteintech公司)，山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(上海碧云天生物有限公司)；多能分化基因qPCR引物(天一輝遠測序公司)；FISH試劑盒：RNAscope? Fluorescent Multiplex Kit、polyA+RNA探針、OCT4 mRNA探針(ACD公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外培養hESCs：將matrigel 鋪至6孔板4 ℃過夜后接種H1克隆。使用mTeSRTM1培養，觀察密度。4～6 d傳代1次：DPBS(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline)清洗細胞，加入1 mL ReLeSR室溫靜置1 min后吸凈。將細胞放至37 ℃孵箱中6～8 min。加入3 mL mTESR1將克隆重懸，傳代至6孔板中進行培養。

1.2.2 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測：收集新鮮的細胞6×106個，用1mL含有蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 16 000×g離心15 min，取40 μL裂解液作為input備用，分成兩管裂解液分別加入5 μg NPC抗體和鼠IgG抗體，4 ℃ 旋轉孵育過夜。將100 μL蛋白A磁珠分別加入到兩管裂解液中，4 ℃旋轉孵育4～6 h。用磁力架吸附磁珠并清洗3次，加SDS上樣緩沖液 50 μL煮沸洗脫蛋白。

1.2.3 分離細胞核和細胞質：使用核質分離試劑盒，按照細胞體積加入適量預冷Cytoplasmic Extraction Reagent Ⅰ(CER Ⅰ)重懸細胞,渦旋振蕩15 s，冰上孵育10 min，加入預冷Cytoplasmic Extraction Reagent Ⅱ(CER Ⅱ)渦旋振蕩5 s，冰上孵育1 min，渦旋振蕩5 s后 16 000×g離心5 min，立即轉移上清至干凈的管中，此為細胞質成分。向剩余沉淀部分中加入適量預冷Nuclear Extraction Reagent(NER),渦旋振蕩15 s后冰上孵育40 min且每10 min振蕩混勻15 s，16 000×g離心10 min，轉移上清至新管中，此為細胞核成分。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達:提取蛋白后進行SDS-PAGE電泳,濕轉法轉到PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后加入二抗室溫孵育40 min，TBST洗膜后用化學發光法顯影。

1.2.5 shRNA載體的構建：通過shRNA干擾片段在線設計網站http://rnaidesigner. Thermofisher.com/ rnaiexpress/以及hnRNPA3的序列,設計1條shRNA并在兩端連接相應的酶切位點黏性末端,序列由天一輝遠生物技術有限公司合成。合成的片段退火，退火得到的片段與pLKO.1載體連接。

1.2.6 克隆形成能力檢測及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色：6孔板每孔5×103個單細胞，培養5～7 d，進行堿性磷酸酶染色，用4%多聚甲醛固定細胞2 min后，PBS洗1次，試劑按照FRV∶Naphthol∶water=2∶1∶1配置好后加入細胞中，室溫避光放置15 min，去掉染色試劑加PBS洗1次后鏡下觀察。

1.2.7 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測RNA: Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA樣品的濃度和純度。M-MLV合成cDNA第一鏈，每個樣品實驗設置3個復孔，檢測總體積為20 μL。程序如下:94 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共 40個循環。RT-qPCR用到的引物見表1。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.8 RNA 熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技術：前1 d將細胞鋪到腔室蓋玻片上過夜。用PBS洗1次后加4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，梯度脫水后用蛋白酶A通透10 min，加RNA探針40 ℃孵育2 h，依次加入擴大信號試劑AMP1、AMP2、AMP3、AMP4孵育，用含有DAPI的封片劑封片，次日用Leica顯微鏡DM6B拍照，使用Cellprofiler軟件進行熒光信號統計。

1.2.9 蛋白質互作網絡預測網站：https://string-db.org/。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 抑制內源hnRNPA3的表達降低了hESCs自我更新能力

在hESCs細胞中構建一條位點特異的shRNA能顯著抑制hnRNPA3蛋白表達(圖1A)，可用于后續功能實驗。抑制hnRNPA3的表達導致hESCs細胞克隆變小(圖1B)，hESCs克隆形成能力降低(P<0.05)(圖1C)，并且在分子水平上促進了分化標志基因的表達(P<0.001)，但多能性標志基因RNA水平未發生明顯的變化(圖1D)。

2.2 hnRNPA3定位在細胞核中并與核孔復合物互作

分離hESCs細胞核與細胞質后，可見細胞質標志蛋白 HSP90和tubulin 蛋白主要定位在細胞質中, 細胞核標志蛋白 fibrillin和tubulin 主要定位在細胞核中，在核質分離成功的情況下，RNA結合蛋白hnRNPA3主要定位在細胞核中(圖2A)。由于hnRNPA3在過去報道中參與胞質RNA轉運[9]，選擇核孔復合物進行Co-IP，在核孔主要組分NUP88、NUP62[5]高度富集的情況下，hnRNPA3與核孔復合物發生特異性結合(圖2B)。

2.3 抑制內源hnRNPA3的表達減弱了OCT4 mRNA及polyA+ RNA的出核能力

抑制hnRNPA3的表達后檢測OCT4 mRNA核質分布發現，WT(wide type) hESCs中OCT4 mRNA 主要分布在細胞質中，當hnRNPA3表達降低后其出現了顯著的核滯留(圖3A)。為探究hnRNPA3對mRNA出核的調控是否具有廣譜性，抑制hnRNPA3的表達后檢測polyA+RNA 核質分布發現，WT hESCs中polyA+RNA 核質均有分布，當hnRNPA3表達降低后在核內有明顯聚集，核質信號比增大(圖3B)。

2.4 hnRNPA3與約1/3的已知出核相關蛋白質結合

過去文獻共報道68個出核相關蛋白質[5]，從蛋白質互作網站預測到hnRNPA3與其中近1/3(20個)數量的蛋白相互作用(圖4A),將其通過蛋白互作網絡進行展示(圖4B),其中包括RNA加帽蛋白NCBP1[6]、NCBP2，剪接相關蛋白SRSF家族[7]，核孔蛋白NUP98[5]、hnRNPA3還與已報道特異性調控多能性mRNA出核的THOC2[8]有互作關系。

圖4 hnRNPA3與出核調控因子的聯系Fig 4 A association between hnRNPA3 and the RNA export factors

3 討論

hESC有一個復雜的基因表達程序，控制自我更新和分化之間的微妙平衡。Oct4是hESCs多能性維持必不可少的基因，其表達的改變會導致hESCs命運發生不可逆轉的變化[9]。雖然轉錄可能在基因調控中起著開關的作用，但近期研究已經開始揭示轉錄后調控機制在維持hESCs狀態的重要性，如非編碼RNA、選擇性剪接、聚腺苷酸化和RNA穩定性[10-12]。因此可能除了轉錄外，還存在轉錄后模塊與轉錄協同作用，控制hESCs中的基因表達網絡。

A.cell localization of marker proteins(Hsp90, tubulin, fibrillin and tubulin) and hnRNPA3 were detected by Western blot；B.enrichment of nucleopore NUP88/NUP62 and the interaction between hnRNPA3 and nucleopore complex were detected by Western blot

A.fluorescence signals of 107 cells in the negative control group and 100 cells in the hnRNPA3 knockdown group(×40), *P<0.001 compared with negative control group; B.fluorescence signals of 170 cells in the negative control group and 221 cells in the hnRNPA3 knockdown group(×40); *P<0.001 compared with negative control group

本研究表明，hnRNPA3對hESCs自我更新能力的維持有重要的作用，主要表現在兩個方面：一方面hnRNPA3不影響多能性基因mRNA表達水平，而是定位在細胞核中且與核孔復合物相互作用，調節多能性基因OCT4 mRNA出核來維持hESCs多能性；另一方面hnRNPA3通過抑制分化標志基因mRNA水平的表達來進一步維持hESCs多能性。然而不能排除hnRNPA3通過其他方式調節多能性的可能性，比如從其廣譜性調節polyA+RNA出核的表現來看，除了調節多能基因外，可能還通過調節其他mRNA的出核來調節多能性。

本研究也探討了hnRNPA3調控RNA運輸的新機制。在經典的出核途徑中，mRNA在細胞核中被RNA結合蛋白加工成熟后賦予出核能力，歷經核質運輸的重要通道核孔進入到細胞質中被翻譯。RNA結合蛋白hnRNPA3與20個已知報道的出核相關蛋白互作，這些出核相關蛋白偶聯了RNA加工和出核過程。hnRNPA3可能在mRNA的加工時或者加工完成后募集到mRNA上，幫助募集一部分出核相關蛋白來幫助加工進而賦予mRNA出核能力，當mRNA在出核相關蛋白的輔助下通過核孔時，hnRNPA3又可以和核孔互作調節核孔的開關或松弛狀態使得mRNA順利運輸到細胞質。之前的研究表明，hnRNPA3還調節細胞質中mRNA的運輸[13]，可見hnRNPA3在mRNA代謝過程中發揮了重要的作用。