羧胺三唑增強小鼠脾臟淋巴細胞促進結腸癌細胞系MC38和C26凋亡

高洪婷，黃雨晴，楊黎星，馬 瑞，王鈺鋮，鞠 瑞，郭 磊

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 藥理系，北京 100005)

結腸癌(colon cancer)是目前世界上常見的癌之一[1]。結腸癌的發病往往具有隱匿性，通常在疾病中晚期才會被發現，迄今為止臨床上尚無有效的根治性治療方法。因此，探索更加有效的治療結腸癌的方法和策略，對人類早日擺脫結腸癌困擾具有重要意義。

羧胺三唑(carboxyamidotriazole，CAI)是一種非細胞毒類小分子抗腫瘤藥物[2]。研究表明，CAI可以抑制鈣離子內流[3]，抑制腫瘤細胞的增殖和血管生成并調節腫瘤微環境[4]，同時該藥物具有抗感染作用[5]。腫瘤微環境是一個極其復雜的系統，與腫瘤的發生發展密切相關。近年來，針對腫瘤微環境調節的腫瘤免疫療法已逐漸成為一種新的治療手段[6]。脾臟是機體中最大的免疫器官，含有大量淋巴細胞以及巨噬細胞，在免疫平衡和免疫調節中具有重要作用。目前，CAI對脾臟淋巴細胞抑瘤作用的影響尚不明確。本研究擬通過觀察CAI對結腸癌細胞系存活和凋亡的影響以及CAI對小鼠脾臟淋巴細胞抑制結腸癌細胞存活、促進細胞凋亡的影響，初步探究其作用機制，以期為結腸癌的治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠(6～8周齡，SPF級，雌性，體質量18～20 g，中國醫學科學院基礎醫學研究所動物中心)。常溫環境飼養(溫度22 ℃±2 ℃，濕度 40%～70%)，12 h明/暗交替。動物自由攝食、飲水。

1.1.2 細胞系：結腸癌細胞系MC38和C26(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)。

1.1.3 藥品與試劑：羧胺三唑(CAI)(中國醫學科學院藥物研究所)；胎牛血清(Gibco公司)；RPMI-1640培養基和DMEM高糖培養基(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)；CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；小鼠淋巴細胞分離液(深圳市達科為生物工程有限公司)；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒、CD4流式抗體、CD8流式抗體和CD3流式抗體(BioLegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養與處理：將MC38細胞培養于RPMI-1640培養基中，C26細胞培養于DMEM高糖培養基中。按小鼠淋巴細胞分離液說明書分離C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的脾臟淋巴細胞，將與MC38細胞同品系的C57BL/6小鼠脾臟淋巴細胞與MC38細胞按照20∶1的比例共培養，將與C26細胞同品系的BALB/c小鼠脾臟淋巴細胞與C26細胞按照20∶1的比例共培養。不同濃度CAI處理細胞。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活：在96孔板中分別接種MC38和C26細胞懸液，調整細胞為1×105個/mL，每孔100 μL，待細胞貼壁后加入不同濃度的CAI，每組設3個復孔，培養48和72 h；或待細胞貼壁后與小鼠脾臟淋巴細胞共培養，1 h后加入不同濃度的CAI，每組設3個復孔，培養48 h。隨后棄去孔中原培養液，每孔加入100 μL無血清培養液和10 μL CCK-8試劑，在培養箱內孵育1～4 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞凋亡：用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞后，4 ℃，300×g離心5 min收集細胞。用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，每次均4 ℃，300×g離心5 min，收集1×105～5×105個細胞。吸棄PBS，加入100 μL 1×緩沖液重懸細胞。加入5 μL annexin V-FITC和10 μL PI染色溶液，輕輕混勻。避光，室溫反應10～15 min。加入400 μL 1×緩沖液，混勻后放置于冰上，在1 h內用流式細胞儀檢測。

1.2.4 流式細胞測量術檢測小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD3+T細胞和CD8+CD3+T細胞的比例：收集細胞至離心管中，室溫，250×g離心10 min，PBS清洗細胞1次。加入流式抗體，4 ℃ 避光孵育30 min，PBS洗1遍，350 μL PBS重懸細胞，過篩后流式細胞儀檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CAI抑制MC38和C26細胞存活

不同濃度CAI處理MC38或C26細胞48、72 h后，A值顯著低于0 μmol/L組(P<0.05、P<0.01和P<0.001)(圖1)。

2.2 CAI增強小鼠脾臟淋巴細胞抑制MC38和C26細胞存活

MC38和C26細胞分別與小鼠脾臟淋巴細胞共培養48 h后，A值顯著降低(P<0.001)；不同濃度CAI處理共培養條件下的MC38或C26細胞48 h后，與單獨小鼠脾臟淋巴細胞處理相比，A值進一步顯著降低(P<0.001)；活細胞數目相比單獨培養的MC38或C26細胞同劑量CAI組的減少比例，超過小鼠脾臟淋巴細胞對腫瘤細胞數目的減少比例(圖2)。

2.3 CAI促進MC38和C26細胞凋亡并增強小鼠脾臟淋巴細胞促進MC38和C26細胞凋亡

不同濃度CAI處理MC38或C26細胞48 h后，凋亡率顯著高于0 μmol/L組(P<0.01和P<0.001)；MC38和C26細胞分別與小鼠脾臟淋巴細胞共培養48 h后，凋亡率顯著升高(P<0.001)；不同濃度CAI處理共培養條件下的MC38和C26細胞48 h后，與單獨處理小鼠脾臟淋巴細胞相比，凋亡率進一步顯著升高(P<0.05和P<0.001)；細胞凋亡相比單獨培養的MC38或C26細胞同劑量CAI組的增加比例，超過小鼠脾臟淋巴細胞對腫瘤細胞凋亡的增加比例(圖3)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖1 CAI對MC38和C26細胞存活的影響Fig 1 Effects of CAI on the survival of MC38 and C26 n=3)

*P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖2 CAI對小鼠脾臟淋巴細胞抑制MC38和C26細胞存活的影響Fig 2 Effects of CAI on that spleen lymphocytes of mice inhibit the survival of MC38 and C26 n=3)

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖3 CAI對MC38和C26細胞凋亡的影響以及CAI對小鼠脾臟淋巴細胞促進MC38和C26細胞凋亡的影響

2.4 CAI升高小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD3+ T細胞和CD8+CD3+ T細胞的比例

不同濃度CAI處理小鼠脾臟淋巴細胞48 h后，小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD3+T細胞和CD8+CD3+T細胞的比例顯著升高(P<0.05，P<0.01)(圖4)。

3 討論

CAI是一種非細胞毒類抗腫瘤藥物，在體內外均能抑制多種腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡。本研究通過檢測MC38和C26細胞的存活和凋亡，證實了CAI對結腸癌細胞MC38和C26存活的抑制作用和促進細胞凋亡的作用，更重要的是發現了CAI能夠在體外促進小鼠脾臟淋巴細胞對結腸癌細胞的殺傷作用。

近年來，腫瘤微環境已逐漸成為腫瘤治療領域的研究熱點。靶向腫瘤微環境的腫瘤免疫療法發展迅速，在惡性腫瘤治療中顯示出強大優勢[7]，同時也面臨眾多機遇與挑戰[8]。其中，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)是腫瘤組織中的浸潤型淋巴細胞，可對腫瘤細胞起到特定的殺傷作用。研究表明，CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞亞群與肺癌患者TILs高密度、細胞毒性增強和生存率提高有關[9]。文獻提示，在原發性腫瘤中，T淋巴細胞浸潤是無復發生存的獨立預后因素[10]。本研究證實小鼠脾臟淋巴細胞使MC38和C26細胞的凋亡率顯著升高，腫瘤細胞的存活受到明顯抑制。CAI進一步加強小鼠脾臟淋巴細胞的抑瘤作用，使大量腫瘤細胞呈現晚凋和壞死狀態，活細胞數顯著減少，表明CAI促進小鼠脾臟淋巴細胞殺傷結腸癌細胞主要是通過增加MC38和C26細胞晚期凋亡以及壞死比例來實現的，顯示出CAI在腫瘤免疫治療上的潛力。進一步檢測后發現CAI增強小鼠脾臟淋巴細胞抑瘤作用可能與上調CD4+CD3+T細胞和CD8+CD3+T細胞的比例有關，但具體作用機制有待進一步研究和探討。

*P<0.05,**P<0.01 compared with 0 μmol/L group圖4 CAI對小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD3+ T細胞和CD8+CD3+T細胞所占比例的影響

綜上所述，本研究初步證實CAI能夠抑制MC38和C26細胞的存活、促進細胞凋亡，并可能通過上調小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD3+T細胞和CD8+CD3+T細胞的比例增強小鼠脾臟淋巴細胞抑制MC38和C26細胞存活、促進細胞凋亡。這為進一步探索CAI在免疫治療中的作用，探究更加有效的結腸癌治療方法提供了實驗依據。同時本研究也存在一定的局限性。腫瘤微環境極其復雜，涉及多種細胞類型，如炎性細胞、成纖維細胞、神經和血管內皮細胞。這些基質細胞通過釋放各種分子重塑周圍區域，在腫瘤的生長過程中起到重要作用[11]。因而單純在體外將小鼠脾臟淋巴細胞與腫瘤細胞共培養可能無法有效模擬體內真實的腫瘤微環境。未來，本課題組將會通過在體實驗繼續探索CAI對腫瘤浸潤淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的影響及其作用機制。