暢昶，鄧青，張勇峰

河南科技大學第一附屬醫院病理科，河南 洛陽471000

自20世紀70年代以來，全球乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢，乳腺癌的防治成為全球公共衛生問題。近些年來乳腺癌的病死率呈明顯下降趨勢，究其原因與乳腺癌早期篩查、綜合治療方法的開展等密切相關，盡管乳腺癌是目前療效最佳的實體瘤之一，但由于腫瘤異質性以及病理特征的多樣性，導致患者預后不盡相同。研究表明，乳腺癌原發灶以及轉移灶間的分子標志物表達水平存在明顯差異，臨床可根據此特征為乳腺癌后續治療方案的合理選擇提供重要參考。因此積極探究乳腺癌的分子生物學發病機制，尋找特異性標志物，可為乳腺癌的靶向治療提供參考，對提高乳腺癌患者的臨床治療效果具有積極意義。驅動蛋白樣DNA結合蛋白（kinesin-like DNA binding protein，KNSL4）自首次從人乳腺癌細胞系中被發現以來，研究證實其具有微管驅動功能和轉錄因子功能，與腫瘤的惡性生物學行為密切相關。自國外學者首次從人肺癌細胞中分離出轉化基因ras以來，研究表明ras基因與肺癌、大腸癌以及胰腺癌等發生有關，且52%的肺腺癌存在ras基因突變。目前國內外關于ras基因突變產物p21ras基因與惡性腫瘤發病和惡性生物學行為關系的研究成為關注焦點。但目前國內關于乳腺癌淋巴結轉移與KNSL4、p21ras基因關系的研究尚處于初步探索階段，基于此本文展開臨床研究，旨在為乳腺癌的早期診治提供重要參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2017年12月河南科技大學第一附屬醫院行乳腺切除術的乳腺癌患者的臨床資料和隨訪資料。納入標準：符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范（2015版）》中有關乳腺癌的診斷標準，且經影像學檢查確診；臨床資料及隨訪資料完善；術前未接受放化療。排除標準：合并其他類型惡性腫瘤；處于特殊時期（如哺乳期、妊娠期等）；合并嚴重內分泌系統疾病；存在凝血功能異常；術前檢查存在遠處轉移。根據納入與排除標準，本研究共納入82例乳腺癌患者，年齡35～56歲，平均（46.01±4.06）歲；TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期38例，Ⅲ期18例；病理分型：鱗狀細胞癌8例，腺癌74例；淋巴結轉移：陽性48例，陰性34例；分化程度：低分化16例，中分化39例，高分化27例。收集82例乳腺癌患者石蠟包埋的乳腺癌組織及其癌旁組織標本，所有標本均經病理檢查確診。

1.2 免疫組織化學染色法檢測KNSL 4、 p21ras表達情況及結果判定

收集乳腺癌組織及其癌旁組織標本，所有標本均采用超敏鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒（購自福州邁新生物技術開發有限公司）進行染色，二甲苯進行脫蠟處理，梯度乙醇水化，乙二胺四乙酸緩沖液對抗原進行修復（共修復20 min）。滴加一抗（購自美國Abcam公司，配制方法：采用磷酸鹽緩沖液按1∶150比例將KNSL4或p21ras單克隆抗體稀釋），4℃孵育過夜，然后磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2 min，滴加二抗（購自北京中杉金橋生物技術有限公司），37℃孵育30 min，然后磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2 min。二甲基聯苯胺液顯色，蒸餾水沖洗，明礬蘇木素復染，0.2%鹽酸分化，再進行乙醇脫水和二甲苯透明及中性樹脂封片，最后于光學顯微鏡下觀察。由2名經驗豐富的病理醫師采用雙盲法閱片，KNSL4、p21ras陽性表達呈棕黃色顆粒狀，均位于細胞核內，高倍鏡下隨機觀察5個細胞數≥200個的視野。根據陽性細胞占比評分：未見陽性細胞為0分，陽性細胞占比≤10%為1分，陽性細胞占比11%～50%為2分，陽性細胞占比51%～80%為3分，陽性細胞占比＞80%為4分；根據染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項評分乘積≥2分為陽性，乘積≤1分為陰性。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerasechainreaction，RT-PCR）檢 測KNSL 4、 p21ras mRNA相對表達量

提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，設計引物并進行三步法擴增，最后對結果進行分析，以β-actin為內參基因，重復測量3次取平均Ct值。采用2法計算KNSL4、p21ras mRNA相對表達量，其中ΔCt=C（t目的基因）-C（t內參基因），ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt。

1.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測KNSL 4、p 21ras蛋白相對表達量

收集KNSL4、p21ras蛋白樣品，檢測蛋白樣品的濃度并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），在蛋白樣品中滴加SDSPAGE蛋白緩沖液，100℃沸水加熱，蛋白完全變性并冷卻后，室溫中將蛋白樣品直接上樣到SDSPAGE凝膠孔中，添加SDS-PAGE電泳液進行電泳，待溴酚藍達到凝膠孔底端附近時停止電泳，對轉膜成功的SDS-PAGE膠進行染色，隨后將蛋白膜置于備好的洗滌液中漂洗，經一抗以及二抗孵育后，回收二抗，添加洗滌液，共3次，采用超敏ECL化學發光試劑盒（BeyoECL Plus）檢測蛋白相對表達量，以β-actin蛋白為內參物。

1.5 觀察指標

①乳腺癌組織、癌旁組織中KNSL4、p21ras的表達情況。②不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL4、p21ras的表達情況。③依據術后6個月隨訪結果將患者分為淋巴結轉移組（

n

=48）、淋巴結未轉移組（

n

=34）。比較淋巴結轉移組、淋巴結未轉移組患者乳腺癌組織中

KNSL4

、

p21ras

mRNA和蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 乳腺癌組織、癌旁組織中KNSL 4、 p21ras表達情況的比較

乳腺癌組織中KNSL4陽性表達率明顯低于癌旁組織，p21ras陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 乳腺癌組織、癌旁組織中KNSL 4、 p21ras表達情況的比較[ n（%）]

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL 4、 p21ras表達情況的比較

有淋巴結轉移的乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL4陽性表達率明顯低于無淋巴結轉移的患者，而p21ras陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（

χ

=7.259、8.524，

P

=0.007、0.004）。不同TNM分期、病理類型、分化程度、分子亞型、腫瘤直徑的乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL4、p21ras陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL 4、p 21ras的表達情況（ n=82）

2.3 淋巴結轉移組、淋巴結未轉移組患者乳腺癌組織中KNSL 4、 p21ras mRNA和蛋白相對表達量的比較

淋巴結轉移組患者乳腺癌組織中

KNSL4

mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于淋巴結未轉移組，而

p21ras

mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于淋巴結未轉移組，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表 3）

表3 淋巴結轉移組、淋巴結未轉移組患者乳腺癌組織中KNSL 4、 p21ras mRNA和蛋白相對表達量的比較（± s）

2.4 乳腺癌淋巴結轉移與KNSL 4、 p21ras表達量的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，乳腺癌淋巴結轉移與KNSL4表達量呈負相關（

r

=-0.653，

P

＜0.01），但與p21ras表達量呈正相關（

r

=0.608，

P

＜0.01）。

3 討論

隨著國內外學者對乳腺癌生物學行為認識的不斷深入，臨床對乳腺癌的治療理念逐步進入綜合治療時代。盡管如此，目前中國女性乳腺癌病死率正以每年3%的速度增長，如何有效降低乳腺癌發病率和病死率成為臨床關注焦點。研究表明，乳腺癌轉移、復發是導致患者病死率高的關鍵，而早期有效預測乳腺癌轉移風險是提高患者生存率和改善預后的關鍵。乳腺癌發生、發展是一個復雜的病理過程，研究表明腫瘤細胞生長和惡化與多種癌基因、抑癌基因失活密切相關，任何一種產物異常表達，如某種癌基因過度表達或某種抑癌基因失活，均會引起腫瘤細胞生長失控以及腫瘤細胞向遠處侵襲轉移。近年來KNSL4、p21ras基因與多種腫瘤發生關系的研究時有報道，KNSL4、p21ras被證實與腫瘤惡性生物學行為密切相關。因此積極探究乳腺癌轉移與KNSL4、p21ras基因的關系，或可為乳腺癌及時有效治療提供參考。

本研究結果顯示，乳腺癌組織中KNSL4陽性表達率明顯低于癌旁組織，p21ras陽性表達率則明顯高于癌旁組織，表明KNSL4、p21ras基因可能參與乳腺癌發生，其中KNSL4在乳腺癌組織中呈明顯下調趨勢而p21ras則呈明顯升高趨勢。最初KNSL4基因是作為一種驅動蛋白基因，主要參與染色體運動、分配和紡錘體聚集等生物學行為。但萬艷芳的研究指出KNSL4基因表達與患者臨床分期、淋巴結轉移密切相關，并證實了通過沉默乳腺癌細胞中KNSL4基因可增強腫瘤細胞的侵襲能力，間接說明KNSL4基因或是惡性腫瘤的一種抑癌基因。而本研究結果則證實乳腺癌組織中KNSL4陽性表達率明顯下調，且淋巴結轉移組患者乳腺癌組織中KNSL4 mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于淋巴結未轉移組，相關性分析提示乳腺癌淋巴結轉移與KNSL4表達量呈負相關，由此推測KNSL4可明顯抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲，從而降低乳腺癌淋巴結轉移風險。腫瘤新生血管在腫瘤發生、發展及轉移中具有重要作用，此外，細胞失控性增生也是腫瘤細胞增殖、轉移的關鍵。相關研究證實，KNSL4基因在腫瘤新生血管及細胞失控性增生中具有重要調節作用，故認為KNSL4參與乳腺癌轉移的機制可能與其調節腫瘤新生血管及細胞失控性增生有關。但本研究未發現乳腺癌TNM分期、分化程度與KNSL4基因表達的相關性，與上述萬艷芳的研究結果不同，可能與本研究對象來源較為集中或樣本量較小所致結果存在一定偏倚有關。

ras基因參與多種惡性腫瘤的發生，其作用機制與ras基因突變產生的活化編碼產物p21ras蛋白表達量升高密切相關，p21ras位于細胞膜內側，在傳遞細胞生長分化信號中發揮關鍵作用。有研究指出，野生型p21ras在結直腸癌中呈高表達，p21ras基因參與直腸癌病理過程。而本研究則證實乳腺癌組織中p21ras陽性表達率明顯高于癌旁組織，且淋巴結轉移組患者乳腺癌組織中p21ras陽性表達率明顯高于淋巴結未轉移組，而進一步相關性分析顯示乳腺癌淋巴結轉移與p21ras表達量呈正相關，說明p21ras作為一種癌基因，參與乳腺癌轉移，促進腫瘤細胞增殖和侵襲。ras基因激活后成為癌基因，研究表明其基因突變形成產物p21ras后，與二磷酸鳥苷的結合能力降低，此時ras蛋白內在的綠色熒光蛋白酶活性也降低，使得ras蛋白以及綠色熒光蛋白酶解離減少，最終腫瘤細胞因失去二磷酸鳥苷與綠色熒光蛋白酶有節制的調節而不可控制地增殖、惡變，故而認為p21ras基因與乳腺癌惡性生物學行為密切相關。

綜上所述，乳腺癌淋巴結轉移與KNSL4、p21ras基因表達密切相關，KNSL4、p21ras可作為乳腺癌淋巴結轉移的一種有效預測標志物。