郭茹玥，韓高華

1大連醫(yī)科大學研究生院，遼寧大連116044

2泰州市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇泰州225300

放療是治療惡性腫瘤最常用的一種手段，主要是通過直接輻射誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤患者生存率的影響通常表現(xiàn)為局部控制腫瘤，減少全身轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，放療除了直接損傷腫瘤細胞外，還可改變腫瘤微環(huán)境，誘導具有治療意義的抗腫瘤免疫反應，同時也激活了免疫抑制途徑，腫瘤放療后的療效與免疫網(wǎng)絡密切相關。輻射腫瘤微環(huán)境可觀察到多層次調(diào)控，包括腫瘤血管系統(tǒng)損傷、免疫微環(huán)境改變、調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）浸潤增多等。在各種類型的腫瘤中，Treg細胞的高浸潤與低生存率有關，可使多種免疫細胞失活、凋亡，為腫瘤細胞的生長浸潤提供庇護所。因此，需要尋找最佳的治療方法減少Treg細胞或減弱其在腫瘤組織中的抑制活性，同時激活腫瘤特異性效應T細胞，提高放療的抗腫瘤免疫反應。

1 Treg的概述

Treg細胞是一類抑制性T細胞的功能亞群，最早追溯到1970年就有研究者提出抑制性T細胞這一概念，1980年有學者在小鼠模型中證實了該細胞具有免疫抑制的作用，1995年Sakaguchi等正式確認其作用并發(fā)表報道。目前許多不同類型的Treg細胞已被鑒定，最突出的類型是自然發(fā)生在胸腺的Treg（natural Treg，nTreg）和外周誘導型Treg（induced Treg，iTreg）。

胸腺T細胞在成熟階段開始表達T細胞受體（T cell receptor，TCR）序列，通過陽性和陰性的選擇產(chǎn)生有功能的T細胞識別外來抗原發(fā)揮其免疫功能。陽性選擇的目的是使那些表達TCR識別自身（或宿主）主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的T細胞存活下來，陰性選擇主要導致與自身MHC-抗原肽親和力高的T細胞被排除。然而，一些具有自身反應性TCR的T細胞在與具有高親和力的自身抗原肽相互作用后可以發(fā)育成Treg。這種自然發(fā)育的Treg占外周CD4T細胞群的5%～10%，并以CD25的高表達和CD45RB亞型的低表達水平為特征，在維持自我免疫耐受和調(diào)節(jié)免疫反應中發(fā)揮著重要作用。iTreg主要來源于外周免疫系統(tǒng)中的CD4T細胞，其形成較為復雜，決定iTreg細胞發(fā)育的關鍵因素包括抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）的類型、分化狀態(tài)以及激活過程中的細胞因子環(huán)境。腫瘤浸潤性樹突狀細胞在分化的未成熟階段被阻斷并具有耐受性，可以刺激Treg細胞分化，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、吲哚胺-2，3-雙加氧酶-1（indoleamine 2,3-dioxy-genase 1，IDO-1）等也可明顯促進CD4T細胞向Treg細胞分化。

2 Treg介導的免疫抑制

Treg細胞是外周對自身和非自身抗原耐受的重要介質(zhì)，通過多種抑制機制實現(xiàn)這種免疫調(diào)節(jié)控制。①細胞接觸依賴機制：Treg細胞表面可表達特異性蛋白分子——叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）、細胞毒T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、TGF-β、糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）等。FOXP3是Treg細胞產(chǎn)生、維持免疫抑制功能的主要調(diào)控基因，在原始T細胞中表達FOXP3可導致機體發(fā)生免疫抑制。研究發(fā)現(xiàn)，具有FOXP3基因移碼突變的小鼠由于缺乏Treg細胞可使效應T細胞活化增加，轉(zhuǎn)染FOXP3的CD4CD25原始T細胞可轉(zhuǎn)化為CD4CD25Treg細胞，產(chǎn)生抑制性細胞因子并表達主要的Treg細胞表面分子，如CD25、CTLA-4、TGF-β、GITR等，這些分子的具體免疫抑制機制將于下文提到。②分泌抑制性細胞因子：Treg細胞通過分泌包括TGF-β、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和白細胞介素-35（interleukin-35，IL-35）等抑制性細胞因子顯示其抑制活性。TGF-β、IL-10主要通過抑制樹突狀細胞和效應CD8T細胞的功能并促進CD4T細胞轉(zhuǎn)化為Treg細胞發(fā)揮作用；IL-10可影響巨噬細胞的分化削弱其殺死腫瘤細胞的能力，其受體缺失的Treg細胞無法維持FOXP3的表達；IL-35是Treg細胞分泌的一種新型免疫抑制分子，在進入組織后通過“感染耐受”使接觸到的非Treg細胞具備抑制其他細胞的能力。③腫瘤微環(huán)境中特定代謝產(chǎn)物如IDO-1、腺苷的局部積累可抑制效應T細胞，促進Treg細胞增殖。腫瘤細胞糖酵解代謝的加速導致葡萄糖的消耗和脂肪酸的增加，脂肪酸代謝促進Treg的發(fā)育。④Treg細胞通過分泌穿孔素、顆粒酶A/B等對B細胞、自然殺傷T細胞（natural killer T cell，NKT）產(chǎn)生抑制作用，此外Treg細胞還能抑制Ⅱ型固有淋巴細胞、NKT細胞、肥大細胞、嗜堿性細胞和嗜酸性細胞的激活。

3 放療對Treg的影響

作為臨床上常用的一種治療方法，放療主要通過直接殺傷腫瘤細胞、阻斷腫瘤血管再生及改變腫瘤免疫微環(huán)境等發(fā)揮其對惡性腫瘤的殺傷效應，后者表現(xiàn)為射線殺傷腫瘤細胞以后釋放抗原物質(zhì)進入腫瘤微環(huán)境中，激活樹突狀細胞并加強APC的呈遞，動員抗腫瘤免疫細胞前往腫瘤組織發(fā)揮腫瘤特異性免疫反應。然而放療在激活抗腫瘤免疫的同時，也可產(chǎn)生免疫抑制作用，這種作用可能與放療引起Treg細胞增加、腫瘤細胞表面程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）上調(diào)、骨髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）浸潤、樹突狀細胞功能受損等有關。放療對Treg的影響是多方面的。①放療引起Treg細胞數(shù)量改變：放療可使所有T細胞增殖，其中Treg細胞最為顯著。Anderson等首先發(fā)現(xiàn)，放療可致Treg細胞增多，且這部分細胞在放療后仍具有免疫調(diào)節(jié)功能。Muroyama等進一步發(fā)現(xiàn)放療后Treg細胞的Ki-67染色增加了自身增殖，明顯使腫瘤微環(huán)境中的Treg細胞增多，且CTLA-4、CD137和轉(zhuǎn)錄因子Helios的表達均高于非放射腫瘤。②放療劑量對Treg細胞的影響：一項數(shù)據(jù)顯示，單劑量或分次劑量2 Gy的局部放療可導致脾臟內(nèi)Treg細胞增加，將劑量增加到20 Gy可使腫瘤浸潤Treg細胞的比例增加一倍。然而也有一些學者發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量的增加Treg細胞呈劑量依賴性凋亡，許多因素可能導致這些研究的不同結(jié)果，如輻射劑量的差異、放療后的評估時間、局部照射與全身照射的差異以及腫瘤與非腫瘤模型的差異。雖然已經(jīng)有許多研究表明放療可使Treg細胞數(shù)量增多，但不同劑量對其數(shù)量變化的影響目前仍有爭議。③放療對Treg細胞表型和功能產(chǎn)生影響：Cao等發(fā)現(xiàn)γ射線輻射后Treg細胞上CD62L、FOXP3、CD45RO、TGF-β表達降低，GITR及凋亡相關基因B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2-associated X protein，BAX）表達增強，這些表型通過劑量依賴型減弱了Treg細胞對自身T細胞的抑制能力并誘導了自身凋亡。Beauford等進一步發(fā)現(xiàn)放療以劑量依賴的方式下調(diào)了Treg細胞上的FOXP3、CD25和CTLA-4表達，誘導淋巴細胞激活基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG3）的表達升高，使其抑制CD8T細胞增殖的能力減弱。這兩個實驗證明了放療可能通過改變Treg細胞的表型影響其抑制功能，且這種改變與照射劑量及分割模式有關。

4 Treg細胞對放療療效的影響

Treg細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，與傳統(tǒng)放療的相互作用可能從根本上影響腫瘤治療的療效。淋巴細胞是放射敏感性最高的細胞，其次是單核細胞、巨噬細胞和APC。即使淋巴細胞是對電離輻射特別敏感的細胞，但單個淋巴細胞亞群的輻射敏感性存在很大的差異，Treg細胞比其他T淋巴細胞或B淋巴細胞亞群更具抗輻射性，其抗輻射作用部分是由促凋亡蛋白下調(diào)和抗凋亡蛋白上調(diào)介導的，TGF-β存在于腫瘤微環(huán)境中也可能有助于腫瘤內(nèi)T細胞的放射抗性。在腫瘤環(huán)境中，Treg細胞與放療療效呈負相關，一方面放療促進了Treg的分化與增殖，另一方面Treg通過其抗輻射及抗腫瘤免疫抑制作用，使腫瘤細胞逃避免疫殺傷，影響放療的療效。

5 放療聯(lián)合Treg相關免疫治療的研究進展

基于上文所述，單純放療所誘發(fā)的免疫增強作用是很弱的，并不足以抗衡放療誘導Treg的免疫抑制作用，總體上放療對Treg細胞的分化、增殖起到促進作用，誘導了免疫抑制，影響放療的療效。隨著靶向免疫治療日益增多，放療聯(lián)合免疫治療引起越來越多的關注，Treg細胞已成為當前聯(lián)合治療的重要靶點。

5.1 抗CTLA- 4單抗聯(lián)合放療

CTLA-4是目前研究最多、臨床應用最廣泛的一個靶點，是Treg細胞表面的抑制性受體。盡管Treg細胞可通過多種途徑抑制體內(nèi)免疫功能，并且每種途徑可能因環(huán)境和免疫環(huán)境的不同而不同，但是在CTLA-4介導的途徑存在缺陷的情況下，即使其他抑制機制更加活躍以彌補該缺陷，Treg也難以維持其自身耐受和免疫穩(wěn)態(tài)。因此，CTLA-4是T細胞應答的一個重要的負調(diào)控因子，并且是在生理和病理免疫反應（包括自身免疫、過敏和腫瘤免疫）中控制Treg抑制功能的關鍵分子靶點。CTLA-4與B7分子結(jié)合可截斷B7/CD28通路，此通路是T細胞活化的重要一環(huán)，該通路被阻斷可使T細胞無法被激活，處于免疫應答失活狀態(tài)。放療可上調(diào)APC表面的B7-1，由于Treg細胞表面的CTLA-4與B7-1的親和力更高，導致放療后更多的表現(xiàn)為免疫抑制。因此為了更好地發(fā)揮出抗腫瘤免疫效應，可以在放療的同時進行抗CTLA-4治療。目前抗CTLA-4藥主要是指Ipilimumab（IPI），它是最早被批準用于臨床的針對Treg的靶向藥，也是治療晚期惡性黑色素瘤的首選藥物。Rudqvist等在乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在對抗CTLA-4單藥耐藥的情況下，放療和抗CTLA-4可顯著增加腫瘤浸潤性淋巴細胞的數(shù)量，且改善小鼠的存活率。目前越來越多的報道證實了放療聯(lián)合全身免疫治療的安全性和有效性。Bang等回顧性分析了多種腫瘤在接受放療聯(lián)合免疫治療后，證明了局灶性姑息性放療與CTLA-4和（或）程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）抑制劑聯(lián)合使用具有良好的耐受性。Formenti等報道了一項Ⅱ期臨床試驗的結(jié)果，該試驗評估了局部放療和IPI在轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者中的療效，結(jié)果顯示客觀緩解率（objective response rate，ORR）及無進展生存期（progressionfree survival，PFS）均優(yōu)于歷史上報道的單獨使用IPI。Ji等發(fā)現(xiàn)與單獨放療相比，抗CTLA-4聯(lián)合放療使腫瘤消退明顯，且顯著改善臨床結(jié)果。

5.2 抗GITR單抗聯(lián)合放療

Treg細胞上的另一熱門靶點是GITR，其是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體蛋白家族的一員，在調(diào)節(jié)性細胞上結(jié)構性表達，效應T細胞上誘導表達的共刺激受體。研究表明，GITR與GITR配體相互作用可為CD4和CD8初始T細胞提供共刺激信號，激活效應T細胞，同時抑制Treg細胞的抑制活性。近年來，GITR作為一個有前景的靶點得到了廣泛的研究，激動劑GITR單抗通過增加效應T細胞活性、減少Treg細胞浸潤增強抗腫瘤反應。Patel等的小鼠膠質(zhì)瘤模型實驗結(jié)果顯示，抗GITR單抗聯(lián)合放療提高了瘤內(nèi)CD4T細胞/Treg細胞比例，促進了腫瘤消退，并顯著提高生存率。然而，近幾年抗GITR單抗聯(lián)合放療相關文獻報道較少，有待進一步觀察GITR對輻射增敏的效果。

5.3 抗CD25聯(lián)合放療

CD25抗原是分子量為55 kD的單鏈糖蛋白，又稱IL-2受體，主要表達于活化的T細胞，其配體IL-2是CD8CTL細胞擴增所必需的。Treg細胞可表達更高親和力的IL-2受體，在腫瘤微環(huán)境中超過效應T細胞以獲得有限的IL-2，并獲得比效應T細胞更大的增殖優(yōu)勢，進一步促進免疫抑制。Oweida等的動物實驗顯示，與單純放療相比，抗CD25治療聯(lián)合放療可增強T細胞的細胞毒性，誘導腫瘤抗原特異性記憶反應，使57.1%的小鼠腫瘤消失。Ji等進一步證明放療聯(lián)合抗CD25單克隆抗體較單純放療在腫瘤中降低Treg，并逆轉(zhuǎn)了放療時腫瘤CD8T細胞和CD4T細胞上PD-1表達增加，抑制了局部放療及遠處未放療腫瘤生長，提高總生存率。然而，也有一些類似研究未能獲得臨床明顯的增強作用，可能的原因是由于活化的效應T細胞也表達CD25，基于CD25的細胞耗竭也可能減少活化的效應T細胞，從而減弱Treg細胞耗竭增強的抗腫瘤免疫作用。考慮到單克隆抗體的給藥時間和劑量也可能是腫瘤免疫中Treg細胞和效應T細胞差異控制的重要因素，因此如何更好地減少Treg細胞又不消耗特異性效應T細胞是進一步需要解決的問題。

5.4 IDO抑制劑聯(lián)合放療

IDO-1是機體內(nèi)天然存在的免疫調(diào)節(jié)酶，大量的研究發(fā)現(xiàn)許多潛在的免疫抑制機制，其中主要機制為微環(huán)境中的色氨酸消耗。近年來，人們逐漸認識到腫瘤與色氨酸分解代謝升高之間的關系，色氨酸通過IDO限制酶代謝為犬尿氨酸，使效應T細胞的細胞周期阻滯和（或）失能，同時促進Treg細胞的成熟和激活，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮直接作用。針對該通路的IDO抑制劑近年來進行了火熱的研究，Zhu等發(fā)現(xiàn)放療對IDO免疫活性的影響具有劑量依賴性，因此在放療時使用IDO抑制劑可以通過逆轉(zhuǎn)T細胞衰竭延緩腫瘤生長。Liu等發(fā)現(xiàn)IDO抑制劑與放療協(xié)同可以下調(diào)Treg細胞，激活樹突狀細胞和效應T細胞，這種聯(lián)合治療可以增強抗腫瘤免疫并抑制腫瘤進展。

5.5 雙重免疫聯(lián)合放療

雙重免疫和放療的聯(lián)合應用通過針對免疫逃逸的多種機制增強抗腫瘤免疫反應，比任何單雙療法更能提高生存率。PD-1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，1992年首次被發(fā)現(xiàn)，主要在活化的T細胞表面表達，其配體PD-L1表達于多種類型細胞如APC、巨噬細胞、腫瘤細胞等，正常情況下兩者結(jié)合可使T細胞持續(xù)活化狀態(tài)中止，防止機體發(fā)生自身免疫性疾病，病理情況下PD-L1在腫瘤細胞中的表達明顯高于其他正常細胞，兩者結(jié)合抑制了抗腫瘤T細胞活化，促進腫瘤生長。已有多項研究表明，放療聯(lián)合抗PD-1/PD-L1治療可以顯著延緩腫瘤生長。Twyman-Saint等通過一項針對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床試驗及小鼠模型實驗發(fā)現(xiàn)，IPI聯(lián)合放療可使腫瘤消退明顯，但耐藥性很常見?？笴TLA-4主要是通過抑制Treg細胞從而增加Teff/Treg比例，而放療可使腫瘤細胞表面受體上調(diào)，因此其耐藥性可能是由于PD-L1在黑色素瘤細胞中上調(diào)，導致T細胞耗竭。該臨床試驗結(jié)果證實了高PD-L1對放療聯(lián)合抗CTLA-4無反應，黑色素瘤細胞上的PD-L1可以使腫瘤逃避基于抗CTLA-4的治療。這些數(shù)據(jù)顯示了抗CTLA-4、抗PD-1/PD-L1、放療三者聯(lián)合應用的必要性，主要是通過激活不同途徑增強抗腫瘤反應并實現(xiàn)持久的腫瘤應答。還有更多的三聯(lián)組合正在被研究，Schoenhals等發(fā)現(xiàn)抗GITR、抗PD-1和放療顯著改善小鼠存活率和局部反應，其中半數(shù)小鼠無腫瘤，且這些小鼠的CD4和CD8效應記憶細胞增多。另外在一些臨床前實驗中，抗TGF-β、抗PD-1聯(lián)合放療也顯示出良好的抗腫瘤效果。這些數(shù)據(jù)揭示了雙重免疫治療聯(lián)合放療克服腫瘤耐藥的潛力。

6 小結(jié)與展望

本綜述回顧了Treg的起源、作用以及運用于臨床治療中的研究進展。放療是目前治療腫瘤的重要方法，射線在照射病灶的過程中使機體的免疫功能受到破壞并影響療效，Treg細胞參與了其免疫失能過程。目前已有越來越多的證據(jù)表明放療聯(lián)合抗Treg治療可逆轉(zhuǎn)其誘導的免疫抑制，增強放療療效，因此針對Treg細胞的研究已成為當前放療聯(lián)合免疫治療的突破點和熱點，尋找更多的Treg抑制劑及如何有效將清除/逆轉(zhuǎn)Treg與放療最優(yōu)化聯(lián)合，是今后關注的重點。