紀梓良，路瑞靜，陳忠，溫志強，鄭清友#

1南方醫科大學深圳醫院泌尿外科，廣東深圳518101

2深圳市寶安區婦幼保健院檢驗科，廣東深圳518133

腎癌是起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，是第二常見的泌尿系統惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的3%。2018年全球新診斷的腎癌患者約403 262例，約占2018年所有新診斷惡性腫瘤患者的2.2%；因腎癌死亡患者約175 098例，約占2018年因惡性腫瘤死亡患者的1.8%。盡管臨床上已經使用了許多分子靶向藥物，但晚期腎癌患者的預后仍然很差。因此，迫切需要進一步闡明腎癌的發病機制，并尋找更有效的腫瘤標志物和治療靶標。環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是繼微小 RNA（microRNA，miRNA）及長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）后，RNA家族又一逐漸被人們認識的新的內源性非編碼RNA。由于circRNA的3'和5'端相連形成共價閉環結構，因此，沒有傳統的線性RNA 5'帽結構或3'聚腺苷酸尾巴，這使它們比線性RNA更穩定。circRNA富含miRNA反應元件，可以充當miRNA的海綿，從而減少miRNA對靶mRNA的抑制作用。近年來，研究表明，circRNA參與了多種腫瘤的發生、發展，如乳腺癌和前列腺癌，但circRNA在腎癌中的作用和功能仍未完全闡明。本研究對3例腎癌患者的腎癌組織及癌旁正常腎組織進行高通量測序，檢測腎癌環狀RNA表達譜，結合生物信息學的方法預測差異表達的circRNA在腎癌中的調控通路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月南方醫科大學深圳醫院行手術切除的腎癌患者3例，分別為44歲男性（腫瘤分期為TNM期）、48歲女性（腫瘤分期為TNM期）、55歲男性（腫瘤分期為TNM期）患者，收集其腎癌組織標本及癌旁（距腫瘤邊緣＞5 cm）正常腎組織標本。納入標準：術后病理檢查均證實為腎透明細胞癌。排除標準：有化療、放療或其他腫瘤史。

1.2 RNA提取和高通量測序

使用TRIzol試劑（Life Technologies，美國）從組織中提取總RNA。使用NanoDrop分光光度計（Isogen Life Science，荷蘭）測量RNA樣品的濃度和純度。若OD值/OD值為1.8～2.1，則RNA樣品的純度合格。由上海天昊生物科技公司（中國）進行高通量測序。通過EpicentreRibo-ZerorRNA去除試劑盒（Epicentre Technologies，美國）消除了核糖體RNA之后，使用Illumina平臺的NEBNextUltra定向RNA庫制備試劑盒（NEB，美國）構建RNA庫。使用Agilent Bioanalyzer 2100系統（Agilent Technologies，美國）對RNA庫進行質量控制和定量評估。

1.3 circRNA鑒定及分析

使用生物信息學程序識別circRNA，包括CIRI2（v2.0.6 版）、CIRCexplorer2（v2.3.3 版）、Mapsplic（ev2.2.1版）、circRNA_finde（rv1.1版）和find_circ（v1.2版）。從GENCODE數據庫下載基因注釋文件（gencode.v19版）和參考基因組（GRCh37.p13版）。通過FastQC評估RNA-seq數據的質量并去除低質量讀數后，獲得純凈的讀數，并使用指定讀數比對儀將其定位至參考基因組。將獲得的circRNA與circBase（140 790個circRNA）數據庫進行比較，確定是否為新發現的circRNA。提取每個circRNA的反向剪接連接點讀數確定circRNA的表達量，用R軟件包對數據進行歸一及后續的差異表達的circRNA分析，倍數變化大于2且

P

＜0.05的circRNA被認為是顯著差異表達的circRNA。

1.4 circRNA/miRNA/靶基因調控通路預測

使用regRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）、circRNA Interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）和starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）預測circRNA/miRNA/mRNA的調控通路。使 用 miRNAda（http://www.microrna.org/）和Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）預 測 相關miRNA的潛在靶基因。使用Cytoscape軟件構建circRNA/miRNA/mRNA網絡。

2 結果

2.1 circRNA在腎癌組織中的表達譜特征

通過高通量測序鑒定circRNA在腎癌組織及癌旁正常腎組織中的表達譜，共鑒定出4661個circRNA，其中有1963個為新發現的circRNA，89.89%（4190/4661）circRNA是外顯子circRNA，其余的circRNA包括4.66%（217/4661）內含子circRNA和5.45%（254/4661）基因間circRNA。這些circRNA廣泛分布在整個人類染色體中，其中，2號染色體包含463個circRNA，而Y染色體僅包含10個circRNA（表1）。circRNA的長度為78～181 652 nt，其中位長度為652 nt，43.77%的circRNA長度為200～600 n（t表2）。

表1 circRNA在腎癌組織中的染色體分布情況

表2 circRNA在腎癌組織中的長度分布情況

2.2 腎癌和癌旁正常組織中circRNA的表達情況

在4661個被發現的circRNA中，1504個cir-cRNA僅于腎癌組織中被檢測到，1840個circRNA僅于癌旁組織中被檢測到，而1317個circRNA在腎癌及癌旁組織中均有表達。與癌旁組織相比，腎癌組織中共發現53個顯著差異表達的circRNA，包括21個表達上調和32個表達下調的circRNA（倍數≥2.0，P＜0.05）。表達上調和下調倍數最高的各4個circRNA（表3）。

表3 腎癌組織中表達上調或下調倍數最高的circRNA

2.3 circRNA/miRNA/mRNA調控網絡的構建

為了進一步研究腎癌中circRNA的潛在生物學功能及調控通路，選取表達差異倍數最高的4個下調和上調的circRNA（表3），利用生物信息學程序構建一個預測的circRNA/miRNA/mRNA相互作用網絡（圖1）。該網絡結合了測序結果中circRNA、mRNA的表達趨勢，以及miRNA與circRNA、miRNA與mRNA預測的調控關系，其中每個circRNA均能與多個miRNA相結合。如表達上調的hsa_circ_0001947能調控miRNA-203b-3p、miRNA-7152-3p、miRNA-26b-3p、miRNA-12114，進而影響下游鈣黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）、卵泡抑素（follistatin，FST）、腦啡肽受體 B1（Ephrin receptor B1，EPHB1）、OCA2等基因的表達。

圖1 circRNA/miRNA/mRNA調控網絡圖

3 討論

隨著高通量測序技術的出現，人們發現僅有2%的人類基因組可以翻譯成蛋白質，而98%的人類基因組僅能轉錄成非編碼RNA。非編碼RNA分為 miRNA、小核RNA、lncRNA和circRNA。circRNA是RNA領域的研究重點。隨著高通量測序技術和生物信息學方法的發展，circRNA在人類腫瘤中的表達情況及作用正逐漸被認識。作為一種基因調控RNA，circRNA已牽涉到多層次的基因調控中，包括替代剪接、miRNA成熟抑制、基因轉錄、RNA-蛋白質相互作用和蛋白質編碼能力。miRNA“海綿”功能是circRNA的重要功能。circRNA能夠吸附并調控靶miRNA，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，提高靶基因的表達水平。

越來越多的證據表明circRNA在腎癌的發生發展中起著重要的作用，例如circRNA_001569能夠作為miRNA-192的分子海綿，促進結腸癌的增殖、侵襲。Liang等通過高通量測序發現circRNA_ABCB10在乳腺癌中呈高表達，且能夠通過作為miRNA-1271的分子海綿下調miRNA-1271的表達，從而發揮致癌基因的作用。Zhang等發現，circ-UBAP2能夠通過調控miRNA-143在骨肉瘤中的表達從而發揮促癌作用。而在腎癌中，Xue等發現circ-AKT3通過改變miRNA-296-3p/E-鈣黏蛋白信號抑制腎癌細胞的轉移。Xiong等發現，circRNA-ZNF609通過競爭miRNA-138-5p，進而調節FOXP4的表達，從而促進腎癌細胞的增殖和侵襲。Li等發現circTLK1通過調控miRNA-136-5p的表達從而促進腎癌細胞的增殖和轉移。

為闡明腎癌中環狀RNA的表達譜特征，本研究對3例腎癌患者的腎癌組織及癌旁正常組織進行高通量測序，共鑒定出4661個circRNA，其中有1963個為新發現的circRNA。大多數circRNA是外顯子circRNA，其余的為內含子circRNA和基因間circRNA。這些circRNA廣泛分布在整個人類染色體中，其中，2號染色體包含最多的circRNA（463個），而Y染色體僅包含10個circRNA。circRNA的 長 度 為 78～181 652 nt，中 位 長 度 為 652 nt，43.77%的circRNA長度為200～600 nt。通過比較腎癌及癌旁組織中circRNA的表達情況，本研究共鑒定出53個在腎癌組織中顯著異常表達的circRNA，包括21例表達上調和32例表達下調的circRNA（倍數≥2.0，

P

＜0.05）。此外，為了進一步研究腎癌中circRNA的潛在生物學功能及調控通路，本研究選取表達差異倍數最高的4個下調和上調的circRNA，構建了circRNA/miRNA/mRNA調控網絡圖，該網絡圖將為后續腎癌中circRNA-miRNA相互作用通路的研究提供理論基礎，進一步了解circRNA在腎癌發生、發展中的作用，并預測其可能的調控通路。例如，在預測圖中，高表達的hsa_circ_0001947能通過調控miRNA-203b-3p的表達，從而影響堿性雙螺旋轉錄調控因子e41（basic helix-loop-helix family member e41，BHLHE41）基因的表達。Dasgupta等發現，miRNA-203b-3p在腎癌中呈明顯低表達，且能抑制腎癌細胞的增殖和侵襲。Shen等卻發現，

BHLHE41

在腎癌組織中呈高表達，且能促進腎癌細胞的增殖。因此可以推測，在腎癌中高表達的hsa_circ_0001947能夠海綿狀吸附miRNA-203b-3p，降低其表達后，解除了miRNA-203b-3p對

BHLHE41

的抑制作用，最終引起

BHLHE41

基因的高表達，從而促進腎癌的發生發展。該網絡圖能為腎癌circRNA的研究提供方向，并篩選可能有意義的circRNA調控通路。當然，僅預測是不夠的，后期仍需進一步的體內試驗、體外實驗加以驗證。

綜上所述，本研究闡明了腎癌中circRNA的表達特征，在腎癌組織中鑒定到了1963個新發現的circRNA，并發現了53個在腎癌組織中顯著異常表達的RNA。通過生物信息學方法在腎癌中預測并構建了circRNA/miRNA/mRNA調控網絡圖，為后續腎癌circRNA相關研究奠定了理論基礎。后期除了擴大樣本量驗證circRNA的表達外，仍需進一步闡明差異表達的circRNA在腎癌中的生物學功能和確切的分子機制。