基于網絡藥理學和分子對接的葛根-靈芝-當歸干預抗氧化機制研究

向 福，艾勇泉，徐俊偉，余時敏，方元平

(1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2. 黃岡師范學院 李時珍大健康研究院，湖北 黃岡 438000；3. 湖北省中科產業技術研究院，湖北 黃岡 438000)

抗氧化是指抗氧化自由基的簡稱。人體在與外界接觸時，受自身的呼吸(氧化)和外界環境因素的影響，體內會不斷地產生自由基[1]。一般來說，人體內自由基數目處于動態的消長平衡過程，對人體不會造成傷害，但平衡被打破時，大量的自由基就會氧化損傷機體細胞，從而引發各種疾病[2]，動脈粥樣硬化、糖尿病、風濕性關節炎、癌癥及衰老過程等疾病的發生與自由基密切相關[3]。

中藥作為一種天然的抗氧化劑應用廣泛，大量研究表明，中藥有效成分可以通過調節和增強機體特異性及非特異性免疫功能，能抑制自由基的產生或直接作用于自由基對細胞及組織的損傷部位[4]。但中藥成分復雜，目前關于中藥的藥理研究主要集中于藥效評價，對于其作用機制的深入研究仍較少[5]。

黃岡大別山地區特色植物資源豐富，中藥材種植面積達110萬畝。葛根、靈芝和當歸均為大別山地區主要藥物植物，其中葛根含有葛根異黃酮、葛根素等活性成分，二者均具有較強的抗缺氧和抗氧化作用[6]；靈芝含有多糖、三萜酸類和生物堿等多種物質，具有多種生物活性、毒性小，是理想的抗氧化劑[7]；當歸含有多糖、揮發油等活性成分，也具有一定的抗氧化活性[8]。但三味中藥在抗氧化作用機制方面研究較少，因此，本研究基于網絡藥理學和分子對接技術，揭示葛根-靈芝-當歸復方抗氧化作用機制，以期為深入研究抗氧化藥理作用機制，為大別山地區葛根、靈芝、當歸等特色藥材資源利用和臨床應用提供證據和方向。

1 材料與方法

1.1 葛根-靈芝-當歸主要活性成分篩選

通過中藥系統藥理分析平臺TCMSP數據庫[9]，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug-Likeness，DL)≥0.18為篩選條件，檢索葛根-靈芝-當歸中的三味中藥活性成分。

1.2 活性成分靶點和疾病靶點篩選

利用TCMSP數據庫檢索活性成分對應靶點，并結合UniProt數據庫查詢靶點對應的基因名，規范靶點蛋白[10]。利用GeneCards數據庫以“anti-oxidant”為關鍵詞檢索，獲取抗氧化的相關靶點，與葛根-靈芝-當歸活性成分對應的靶點取交集，獲得葛根-靈芝-當歸干預抗氧化的潛在靶點。

1.3 構建葛根-靈芝-當歸活性成分-靶點網絡

利用Cytoscape軟件構建活性成分-靶點網絡，根據各個節點的中心度值(Degree)、介度(Betweeness Centrality)等數據，分析活性成分和靶點。

1.4 構建葛根-靈芝-當歸PPI網絡圖和頻次分布圖

將干預抗氧化的潛在靶點導入STRING數據庫，物種選擇“Homo sapiens”，設置蛋白互作綜合得分>0.7，其余參數不變，隱藏游離靶點，得到PPI網絡圖，下載其TSV文件格式，導入Cytoscpe繪制蛋白相互作用網絡圖，對超過平均度值的靶蛋白進行頻次分析。

1.5 潛在靶點的GO功能及KEGG通路富集分析

將葛根-靈芝-當歸干預抗氧化的潛在靶點導入DAVID數據庫，得到生物過程、細胞成分、分子功能和KEGG通路數據[11-12]，以P<0.05為篩選條件，選取排名前20的條目繪制圖形進行可視化分析。

1.6 分子對接

選擇1.3中突出的前5種活性成分作為小分子，進行加氫、加電荷處理，選擇1.3和1.4交互的核心靶點作為靶點蛋白，從PDB數據庫下載靶點文件。利用Autodock軟件對蛋白進行去水、加氫、加電荷處理，并進行小分子與蛋白對接處理，獲取對接能量，通過PyMOL軟件進行可視化處理。

2 結果

2.1 葛根-靈芝-當歸主要活性成分篩選

通過TCMSP數據庫，以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共尋找到67種活性成分：靈芝61種(靈芝活性成分過多，只列出突出的4種成分)、葛根4種及當歸2種活性成分(表1)。葛根中葛根素(puerarin)的OB值雖小于30%，但DL值為0.69，且其功效突出，故將其計入其中，所以共計68種活性成分，有效成分β-谷甾醇(β-sitosterol)為三種中藥共有活性成分，故考慮此活性成分為葛根-靈芝-當歸復方干預抗氧化的主要活性成分。

表1 葛根-靈芝-當歸復方部分活性成分表

2.2 葛根-靈芝-當歸和抗氧化靶點篩選

通過TCMSP數據庫查詢葛根-靈芝-當歸68種活性成分對應的靶點，刪除重復值共得到109個靶點，并結合UniProt數據庫查詢靶點對應的基因名，規范靶點蛋白。

通過GeneCards數據庫以“anti-oxidation”為關鍵詞對其檢索，共得到982個靶點，根據藥物活性成分靶點和抗氧化靶點，繪制韋恩圖，共得到56個重復靶點，即為葛根-靈芝-當歸干預抗氧化的潛在靶點(圖1)。

圖1 葛根-靈芝-當歸和抗氧化靶點韋恩圖

2.3 構建成分-靶點網絡圖

將葛根-靈芝-當歸篩選得到的主要活性成分和潛在干預抗氧化的靶點導入Cytoscape軟件建立成分-靶點網絡(圖2)，其中“KYH”表示葛根-靈芝-當歸干預抗氧化的潛在靶點，“FF”表示葛根-靈芝-當歸復方活性成分。度值表示預測出該成分與作用靶點的關聯個數，成分度值越大說明該成分越重要。在與潛在靶點相互作用的活性成分中，Degree大于平均值的活性成分有5種，分別是β-谷甾醇、葛根素、刺芒柄花素(formononetin)、3'-甲氧基大豆黃素(3'-methoxydaidzein)、豆甾醇(stigmasterol)，Degree大于平均值的靶點有PTGS2、PTGS1、JUN、BCL2、CASP8、PPARG等。從圖2可知，一個成分對應多個靶點，同時多個成分也對應著一個靶點，表明葛根-靈芝-當歸是多成分、多靶點共同干預抗氧化。

圖2 葛根-靈芝-當歸活性成分和干預抗氧化潛在靶點網絡圖

2.4 葛根-靈芝-當歸PPI網絡構建

將葛根-靈芝-當歸和抗氧化共同靶點導入STRING數據庫，結果信息導入Cytoscpe進行分析，共得到52個節點(去除4個游離的節點)，227條邊，如圖3所示。節點越大、顏色越深，表明對其靶點調控的活性成分越多。由圖2中Degree≥8的AKT1、STAT3、JUN、TNF、VEGFA、PTGS2等19個靶點，繪制圖4所示頻次分布圖，其中圖3涉及的靶點包含成分-靶點網絡中主要靶點，兩圖的主要靶點相互關聯，推測葛根-靈芝-當歸可能通過JUN、CASP8、PPARG、CASP3、PTGS2等靶點作用于抗氧化。

圖3 葛根-靈芝-當歸干預抗氧化的潛在靶點PPI網絡圖

圖4 葛根-靈芝-當歸與抗氧化共同靶點頻次分布

2.5 潛在靶點的GO功能和KEGG富集分析

將葛根-靈芝-當歸干預抗氧化的潛在56個靶點導入David數據庫，進行GO(Gene ontology)分析和KEGG(KEGG pathway analysis)代謝通路富集分析。GO分析結果(圖5)顯示，生物過程中主要包括對藥物的反應(response to drug)、凋亡過程的負調控(negative regulation of apoptotic process)、老化(aging)等；由細胞成分可推測這些靶點主要集中在胞質溶膠(cytosol)、細胞質(cytoplasm)、核質(nucleoplasm)等；分子功能主要集中于相同的蛋白質結合(identical protein binding)、酶結合(enzyme binding)、轉錄因子結合(transcription factor binding)等。KEGG通路分析結果表明，主要通路集中于癌癥的途徑(Pathways in cancer)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、細胞凋亡(Apoptosis)等(圖6)。因此，葛根-靈芝-當歸可能通過老化、凋亡過程的負調控、抗缺氧的反應等方式對氧化起著抑制作用，從而干預抗氧化。

圖5 靶點的GO富集分析：生物過程，細胞成分，分子功能

圖6 靶點的 KEGG 富集分析圖

2.6 分子對接分析

為了驗證網絡藥理學預測葛根-靈芝-當歸三味中藥活性成分抗氧化作用靶點的可靠性，采用分子對接方法從理論上對與排名靠前的靶點的結合能力進行了驗證，結果見表2，三味中藥部分活性成分可與JUN、CASP3、CASP8、PPARG靶點發生結合，其結合自由能均小于0 kJ/mol，表明突出成分與上述靶點具有較強的結合力，且三味中藥突出成分β-谷甾醇、刺芒柄花素、3'-甲氧基大豆黃素、豆甾醇與靶點間的結合能均存在小于-5 kJ/mol的情況，表明突出活性成分和核心靶點間有較大的結合能力，葛根-靈芝-當歸復方部分活性成分與靶點的分子對接復合體可視化結果見圖7。

表2 葛根-靈芝-當歸部分活性成分與突出靶點分子對接結果

圖7 葛根-靈芝-當歸部分活性成分與靶點的分子對接復合體

3 討論

《素問百·至真要大論》記載“君一臣二，度制之小也”。《神農本草經》所記載上、中、下三品之藥，分別為君、臣與佐使，功能各有不同[13]。葛根，《神農本草經》將其列為中品，葛根含有葛根異黃酮成分、葛根素等活性成分，研究表明，二者均具有較強的抗缺氧和抗氧化作用[6]。靈芝，《神農本草經》將其列為上品，含有多糖、三萜酸類和生物堿類等多種物質具有多種生物活性，毒性小，是理想的抗氧化劑[7]。當歸，《神農本草經》將其列為中品，發現其含有多糖、揮發油等活性成分，也具有一定的抗氧化活性[8]。以靈芝為君藥，葛根和當歸為臣藥組成的一君二臣復方是一種小劑量復方，在抗氧化方面具有一定作用。

3.1 多成分-多靶點干預抗氧化

葛根-靈芝-當歸可能通過調控JUN、CASP3、CASP8、PPARG等靶點抑制抗氧化。其中JUN是組成轉錄因子AP-1的重要亞基，可以負調控TP53的表達，從而參與調控機體氧化還原反應[18]。PPARG可直接調控與氧化應激相關基因的表達，以應對機體氧化應激損傷，既可促進抗氧化基因表達，也可抑制促氧化基因表達[19]。CASP3和CASP8在細胞凋亡過程中起重要作用，其中CASP3當細胞受到損傷時，其主要表現為線粒體膜損傷，線粒體內的細胞色素釋放到細胞外，激活CASP3從而誘導細胞凋亡，從而延緩衰老[20]。

3.2 多通路干預抗氧化

葛根-靈芝-當歸和抗氧化的56個潛在靶點在“Pathways in cancer”、“TNF signaling pathway”和“Apoptosis”通路富集程度較高，三者涉及的共同靶點為CASP3、AKT1、FOS、PIK3CG。CASP3可以誘導細胞凋亡，從而延緩衰老[20]，AKT1參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程，是參與氧化應激的主要激酶[21]。FOS和PIK3CG等基因也多在由自由基引起的動脈粥樣硬化和癌癥等疾病中表達，參與疾病的調控。因此當機體發生氧化作用時，可能通過以上通路中的靶點作用來干預抗氧化。

綜上所述，基于網絡藥理學和分子對接技術發現，葛根-靈芝-當歸能通過多成分、多靶點、多通路的作用模式來干預抗氧化。但是，中藥復方的使用并不是各味中藥有效成分簡單的疊加，且目前對于中藥活性成分的研究仍存在不足，使得該類技術仍存在一定的局限性。