HPLC法測定食品中脫氫乙酸含量的優化措施

孫紅英，郭偉(臨沭縣檢驗檢測中心，山東 臨沂 276700)

0 引言

隨著我國經濟的不斷發展，人們的生活水平不斷提高，食品多樣性逐漸強化，食品的安全生產問題得到了廣泛關注。食品安全問題由來已久，而當前讓人們最為焦慮的問題就是食品中的防腐劑超標，而脫氫乙酸以及其對應的鈉鹽是當前各類食品當中常用的一種防腐劑，它可以一種多種細菌的繁衍，對食品腐化有較高的抑制作用，但它的缺點也非常明顯，對人體有害且極易進入血液，因此我國對該物質在食品中的應用有嚴格要求。為了保證人們的食品安全，食品檢驗部門要嚴格依照國家規范要求對食品中脫氫乙酸的含量進行檢測。高效液相色譜法是一種常用的添加劑檢測技術，文章通過將脫氫乙酸溶入溶劑后液相色譜的峰值變化情況對脫氫乙酸含量進行了分析。

1 脫氫乙酸含量檢測需求分析

脫氫乙酸以及其相關的鈉鹽是食品中最常見的防腐劑，能夠廣泛應用在醬菜、糕點以及果蔬汁上，并且特點和優點很多，如：它非常高效，且毒性很低，同時也可以抑制酵母菌和霉菌，實際應用中有很多可取之處。不過與此同時，脫氫乙酸及其鈉鹽也存在著一些負面影響，危害人體健康，因為它可以被人體快速吸收，然后迅速分散在血液中，存在于各種器官中，并且抑制氧化酶，讓人體健康受到很多負面影響。為了保證人體健康，國家對此進行了嚴格的要求，針對不同種類的食物都有嚴格的標準，明確規定了脫氫乙酸及其鈉鹽的含量，最大含量不能超過1.0 g/kg。針對脫氫乙酸含量的測量方法，我國也有規定，在國標GB 5009.121—2016上標注得很清楚，其中氣相色譜法本身比較復雜，并且影響因素很多，實際用時重復性差，測量結果不準確，所以行業內常常使用高效液相法來進行檢測[1]。

2 高效液相色譜法檢測技術介紹

高效液相色譜技術簡稱為HPLC，也被稱為高效液相層析法，它是20世紀60到70年代由業內專家研發的一種分離分析技術，在化工產業不斷發展的時代背景下，HPLC技術在化工分析中得到了廣泛應用，當前已經在各種化工材料、藥品、食品等檢驗分析中得到了普遍認可。HPLC可以根據分離機制進行分類：其一為液固相吸附色譜，其二為液液分離色譜，其三則是離子交換色譜，還包括離子對色譜技術等。在實際應用中HPLC的應用系統通常由輸液泵、進樣裝置、分離色譜柱以及參數檢測裝置等組成[2]，當前為了提升HPLC的應用效果還搭載了智能化的數據記錄及分析系統，其分析結果具有較高精準性，其中制約色譜檢測質量的重要結構為色譜柱及檢測裝置。部分制備型HPLC還會增加自動餾分收集設備，以保證液相物質分離與檢測效果。總體來說，高效液相色譜檢測技術是一種基于經典色譜檢測技術的高效率檢測方法，它結合了氣相色譜法的經典理論，同時在檢測過程中配套高壓輸送流動性的方式，檢測所用的色譜柱為小顆粒填充料色譜柱，檢測過程中還應做好靈敏度優化，選用檢測器時注意選擇靈敏度高且穩定可靠的檢測設備，并要確保檢測流出及回收效果，從當前的檢測結果來看，高效液相色譜檢測技術的檢出效率高且如果流動相選擇得當，檢測效果也非常可觀，檢測靈敏度符合國標要求。

試驗中我們做了前處理的優化和色譜條件優化，以此來保證后期檢測效果。由于國標規定的流動相為乙酸銨溶液及甲醇，它在進行脫氫乙酸檢測時存在一定的色譜峰拖尾問題，為了改善這一問題，必須選擇檢出效果更好的溶液代替乙酸銨溶液，我們就這一問題進行了分析，發生色譜峰拖尾問題的主因就是乙酸銨容易在脫氧乙酸及色譜柱結構作用下發生了pH變化，導致色峰值檢測時出現了誤差從而發生拖尾，因此必須根據檢測要求進行流動相優化，本次研究中選擇磷酸水溶液替代常用的乙酸銨，檢出效果符合國標要求且能夠改善色譜峰的一些圖像問題[3]。采用乙酸銨溶液流動相時的拖尾現象如圖1所示。

圖1 采用乙酸銨溶液流動相時的拖尾現象

3 食品樣品檢測脫氫乙酸含量的液相色譜法分析

（1）樣品的制備與提取。稱取均質后的樣品2g（精確至0.001g），置于50 mL離心管內，依次加入10 mL甲醇和10 mL水，超聲提取30 min后，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液1 mL和乙酸鋅溶液1 mL，加水定容至25 mL，4 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜過濾后，供高效液相色譜儀測定。

（2）色譜條件。色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；紫外或二極管陣列檢測器；檢測波長：293 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇＋0.1%磷酸水溶液（55＋45）。

（3）試驗結果

①優化流動相。食品檢測中常用的液相色譜檢測流動相為甲醇及乙酸銨溶劑，但是在實際檢測中該流動相檢測脫氫乙酸時有一定的拖尾現象，對檢測結果有一定影響，因此要積極探索優化流動相的方法。因為脫氫乙酸分子中所含羧基非常容易同色譜柱結構當中硅羥基進行反應而生成氫鍵，所以也應積極優化流動相pH值，在實驗中對流動相的溶液成分及比例進行研究，多次對比后認為甲醇及0.1%磷酸水溶液（55+45）能夠更好地提升檢測結果，吸取脫氫乙酸貯備液適量，至5 mL容量瓶中，加水至刻度，配制成濃度為100 μg/mL標準工作液，流動相為-甲醇+0.1%磷酸水溶液（55+45），其檢測色譜圖如圖2所示。

②線性。確定好流動相后需要確定檢測的線性方程式，因此需要進行多次不同濃度標準工作液的色譜檢測，通過多次試驗獲取不同濃度脫氫乙酸的檢測線性圖如圖3所示，通過線性圖分析可以獲得脫氫乙酸檢測的相關系數，并獲取本次試驗檢

③精密度及回收率

測定試驗中選取六組共計36份空白檢驗樣品，每組選用統一濃度脫氫乙酸溶液，并依照本次試驗設定的色譜檢測條件進行脫氫乙酸含量測定，其測定結果如表1所示，其測定結果相對準確且回收率較高，適用于食品添加劑檢測檢驗工作。

圖3 高效液相色譜法檢測脫氫乙酸的線形圖

表1 試驗檢測脫氫乙酸含量及回收率、檢測精密度

④檢出限

為了獲取檢出限數值，選擇3份空白試樣，在其中加入脫氧乙酸溶液使之整體濃度為0.002 g/kg,并根據之前試驗確定好的前處理方案以及色譜檢測條件進行脫氫乙酸檢測，檢測結果顯示，該條件下檢測出脫氫乙酸信噪比超過3，由此可以推到這一檢測設備及條件方案的脫氫乙酸組分檢出限為0.002 g/kg.在以后的檢測過程中可以參照。

4 結語

總之，在我國食品檢驗工作中應用高效液相色譜技術檢測食品添加劑的效果較好，并且由于液相色譜的對比試驗效率高，且可以多次檢測形成方程式，并通過曲線圖分析獲取添加劑含量因此得到了行業認可，在食品檢驗中應用得非常廣泛，在具體檢測工作中要根據檢測組分特性以及檢驗精度需求進行溶劑選擇，本文中所選的甲醇及0.1%磷酸水溶液不僅能夠很好地溶劑脫氫乙酸，并且與脫氫乙酸成分在色譜峰值上有較大差異，并且在多次標準溶液的檢測中也能夠表現出較為穩定的色譜檢出性質，因此選取溶液較為科學，同時所用試驗檢測參數也非常合理，因此具有實際應用價值。