實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理及在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

史曉霞

摘要：PCR技術(shù)主要工作是分析食品樣品中微生物的指令基因，從而辨別食品樣品當(dāng)中微生物的種類及數(shù)量，以達(dá)到食品檢驗(yàn)工作的目的。本文主要分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的技術(shù)原理及其在食品檢測(cè)中的具體應(yīng)用，僅供參考。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù);食品檢測(cè);應(yīng)用

一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

1.傳統(tǒng)PCR技術(shù)

微生物檢測(cè)中的PCR技術(shù)就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱為無細(xì)胞分子克隆技術(shù)。在微生物檢測(cè)中應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)食品安全，首先要搜集微生物中的細(xì)菌細(xì)胞，將細(xì)胞中的DNA進(jìn)行分解，然后根據(jù)微生物中所持有的特點(diǎn)設(shè)計(jì)所需的引物，最后運(yùn)用電泳法技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌中DNA的排列順序。在微生物檢測(cè)中運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌具有靈敏度高及特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可以快速檢測(cè)出食品中含有的細(xì)菌種類及狀態(tài)。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理

實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)基礎(chǔ)在于：實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，基本原理相同，主要區(qū)別是其定量體系。將熒光染料或熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，使之具有特定波長(zhǎng)。利用熒光信號(hào)，可對(duì)整個(gè)聚合酶反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)自動(dòng)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。測(cè)量到的信號(hào)將被用來作為聚合酶鏈反應(yīng)周期熒光閾值的坐標(biāo)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法中主要包括：（1）絕對(duì)的定量措施，通過構(gòu)建合理的基因序列標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)其進(jìn)行一系列的定量檢測(cè)工作，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行合理的稀釋工作之后，可以獲得多個(gè)不同稀釋之后的Ct數(shù)值。（2）相對(duì)定量：其主要是檢測(cè)人員不需要做一些額外的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其具有簡(jiǎn)便、省時(shí)等優(yōu)勢(shì)。

檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，若應(yīng)用常規(guī)PCR技術(shù)只能檢測(cè)終點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是將熒光基團(tuán)融入到PCR反應(yīng)系統(tǒng)中，對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行觀測(cè)從而觀察實(shí)驗(yàn)全過程，其中指數(shù)增長(zhǎng)階段數(shù)據(jù)分析最為適用，并且樣品DNA含量與Ct值（循環(huán)數(shù)）二者間的關(guān)系為線性，因此，樣品的定量分析可在完成標(biāo)準(zhǔn)曲線制定后開展。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可分為SYBRGreenreal-timePCR和Taq[1]Manreal-timePCR。SYBRGreenreal-timePCR熒光染料可以實(shí)現(xiàn)以特異性方式插入DNA雙鏈中，并將熒光信號(hào)輸出，SYBR熒光染料未插入DNA雙鏈中則分子不會(huì)出現(xiàn)熒光，對(duì)于熒光信號(hào)觀察過程中通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱程度來確定PCR產(chǎn)物含量。DNA擴(kuò)增后，該技術(shù)可以通過溶解曲線對(duì)單堿基突變進(jìn)行檢驗(yàn)。TaqManreal-timePCR熒光強(qiáng)度改變是通過熒光標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)解離來實(shí)現(xiàn)的。在探針完整的情況下，猝滅基團(tuán)可以將報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)吸收;而擴(kuò)增過程中，探針被酶切，2個(gè)基團(tuán)分離，故產(chǎn)生熒光信號(hào)并被接收，最終通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來觀測(cè)產(chǎn)物的形成。這樣的方式主要特點(diǎn)是模板與探針融合和水解使特異性更強(qiáng)，而且不需要進(jìn)行電泳，簡(jiǎn)化了流程，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)反應(yīng)將多種肉類同時(shí)進(jìn)行鑒定的目的。

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

1、動(dòng)物源性檢測(cè)

以TaqManreal-timePCR為基礎(chǔ)，根據(jù)牦牛細(xì)胞色素B基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并與其他動(dòng)物物種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，擴(kuò)增曲線僅牦牛能夠形成，并且與其他物種DNA之間不存在交叉反應(yīng)，靈敏度可達(dá)到0.001%，對(duì)牛肉的摻假檢測(cè)具有重要意義。李亮等[45]則利用牛線粒體和16SrDNA內(nèi)參基因進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中牛的DNA水平和總DNA水平，以此計(jì)算出回收率（平均回收率為98.62%）。由于線粒體DNA在不同組織中拷貝數(shù)不同，而細(xì)胞核DNA具有高度保守性和一致性，且在同一物種的不同細(xì)胞中拷貝數(shù)基本一致。所以目標(biāo)基因的設(shè)立除了線粒體，還可以是核基因。此外，利用單拷貝核基因設(shè)計(jì)引物和探針并運(yùn)用熒光定量PCR的方法進(jìn)行了羊肉的摻假檢測(cè)，由于在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，若僅應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量會(huì)存在一定的誤差，因此，該試驗(yàn)中引入了1個(gè)常數(shù)（修正因子）將摻假肉中的DNA濃度轉(zhuǎn)化為目標(biāo)肉類所占的比例，以此提高肉類摻假檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2、食源性致病菌檢測(cè)

沙門氏菌是食物中最重要的食源性病原菌之一。數(shù)據(jù)顯示，沙門氏菌在我國(guó)及世界各地的食物中毒病原菌中占很大比例，對(duì)人類和動(dòng)物造成極大傷害，導(dǎo)致食物中毒、傷害、腸胃炎等諸多疾病。通過對(duì)inva基因設(shè)計(jì)引物，用熒光染料法建立沙門氏菌RTQ-PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示沙門氏菌檢測(cè)下線達(dá)到101cfu/ml，靈敏度高，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)肉制品中的沙門氏菌，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短。采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法對(duì)生豬肉、生雞肉、生菜沙拉和羊乳制品中沙門氏菌的檢測(cè)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，該方法快速、有效、檢測(cè)范圍廣，符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，具有實(shí)用價(jià)值。

3、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)

隨著大量轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)入市場(chǎng)，轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)簽和安全性問題越來越受到人們的關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在著靈敏度低、操作繁瑣、誤報(bào)率高等缺點(diǎn)。建立準(zhǔn)確、快速、靈敏的鑒別方法已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為一種新技術(shù)，在分子水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分具有較高的準(zhǔn)確性，因此廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分的定性、品種鑒定和含量檢測(cè)。利用轉(zhuǎn)基因小麥外源片段和染色體邊界序列設(shè)計(jì)引物，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小麥b73-6-1、b72-8-11b和b102-1-2品系，同時(shí)以轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻和非轉(zhuǎn)基因小麥為對(duì)照，結(jié)果表面該方法特異性好，靈敏度可達(dá)0.01%（m/m），為檢測(cè)具有同樣外源基因的不同轉(zhuǎn)基因小麥品系提供了一種更高效的方法，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)語

本文主要從傳統(tǒng)PCR技術(shù)入手，重點(diǎn)分析了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用原理，及其在食品檢測(cè)中的具體應(yīng)用，包括在動(dòng)物源性檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)以及食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用，研究表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)較為明顯，且滿足當(dāng)代食品安全發(fā)展需要。

參考文獻(xiàn)

[1]高鑫，朱武洋，盧學(xué)新.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2018，34（07）：660-667.