miR-195在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達變化及其過表達對瘤細胞腫瘤生物學特性的影響

盛秀云，張磊，王艷軍

聊城市第二人民醫院，山東聊城 252600

彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）為彌漫性增生的 大B細胞惡性腫瘤，是一種最常見的非霍奇金淋巴瘤，在我國，DLBCL約占非霍奇金淋巴瘤的50%［1］。雖然40%的DLBCL患者經過R-CHOP方案的治療后能夠達到持續緩解，但治療過程中仍然會有35%～45%的DLBCL患者治療無效或者效果不理想，DLBCL總體治療效果仍不能令人滿意［2-4］。隨著分子生物學研究的飛速發展，越來越多的研究集中于尋找潛在的惡性腫瘤分子靶點來用于新的腫瘤治療，但至今尚未發現在DLBCL治療中療效顯著的靶向治療關鍵基因靶點。近年來，有關DLBCL的一些分子發病機制已被初步發現［5］。除了編碼基因外，還有一些非編碼基因，特別是微小RNA（miRNA），被廣泛認為是調控DLBCL發生發展最重要的靶點之一［6］。mi R-195屬于miR-15、16/195家族重要成員之一，定位17p13.1，在肺癌［7］、結腸癌［8］、食管癌［9］、前列腺癌［10］等許多惡性腫瘤中表達異常，參與腫瘤發生和發展的調控。近期研究發現，miR-195在DLBCL患者腫瘤組織中表達明顯降低，并且與患者預后相關［11］，但mi R-195在DLBCL中的作用機制尚不清楚。本研究旨在檢測miR-195在DLBCL細胞中的表達及其過表達對瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等腫瘤生物學特性的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（日本TaKaRa公司）；CCK-8檢測試劑盒、RIPA裂解緩沖液（江蘇碧云天生物技術研究所）；Lipofectamine2000脂質體轉染試劑（美國Invitrogen公司）；miR-195 mimics、NC-mimics（上海吉瑪制藥公司）；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；Matrigel膠（美國BD公司）；一抗HMGA2、GAPDH抗體（美國Abcam公司）；HRP標記的二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 細胞來源及培養 人DLBCL細胞系U2932、HBL1、OCI-LY-10及人正常B淋巴細胞系IM-9購自上海雅吉生物公司，均置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2的培養箱中培養，細胞生長融合度達到70%～80%時進行轉染操作。

1.3 細胞轉染 取對數生長期的OCI-LY-10細胞，接種于6孔板，按照Lipofectamine2000脂質體轉染試劑說明書提供的實驗流程，將miR-195模擬物（miR-195 mimics）、模擬物陰性對照（NC-mimics）分別轉染至OCI-LY-10細胞，將轉染后細胞設為miR-195 mimics組、NC-mimics組。

1.4 細胞中miR-195表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。按照TRIzol試劑說明書提取U2932、HBL1、OCI-LY-10、IM-9及miR-195 mimics組、NC-mimics組細胞總RNA，分光光度儀檢測RNA的濃度及純度。取總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將逆轉錄酶、逆轉錄引物配置反應體系進行逆轉錄獲得cDNA。取cDNA和PCR引物，按照SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒說明書配制PCR反應體系，反應條件設置如下：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10s，共40個循環。miR-195引物上游序列：5′-GGCTAGCAGCACAGAAAT-3′，下游序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物上游序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游序列：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-195的相對表達量。

1.5 細胞增殖情況觀察 采用CCK-8實驗。取miR-195 mimics組、NC-mimics組細胞，以5×104/孔接種于96孔板中，在37℃、5%CO2培養箱中培養，轉染24、48、72、96 h時每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續避光孵育2 h，酶標儀測定各孔450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.6 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。收集轉染24 h后的miR-195 mimics組、NC-mimics組細胞，應用1×Annexin V結合緩沖液懸浮，將5μL PI和5μL Annexin V/FITC的混合物添加到細胞中并培養孵育25 min，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 細胞侵襲和遷移能力觀察 采用Transwell小室侵襲及遷移實驗。侵襲實驗時，Transwell小室置于24孔板內，小室內膜預先均勻涂抹Matrigel膠凝固成膜。取轉染24 h后的miR-195 mimics組、NC-mimics組細胞，胰蛋白酶消化，用無血清培養基制成2×104/mL的細胞懸液，Transwell上室每孔加入200μL細胞懸液，Transwell下室則加入500μL培養基（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2的條件下經過24 h培養后取出Transwell小室，擦除上室內膜黏附的細胞，而后甲醛固定細胞，染色，倒置光學顯微鏡下隨機選取6個視野計數穿膜的細胞數。遷移實驗時，Transwell小室內膜上不預先涂抹Matrigel膠，之后進行上述同樣操作步驟。以穿膜細胞數目表示腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。

1.8 高遷移率族蛋白A2（HMGA2）蛋白檢測 采用Western blotting法。收集mi R-195 mimics組、NC-mimics組細胞，加入RIPA裂解緩沖液，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取等量蛋白樣品，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，后轉移至PVDF膜（微孔膜）上，37℃、5%脫脂牛奶里室溫封閉1 h，4℃下加入一抗HMGA2和GAPDH抗體，4℃培養過夜，再加入HRP標記的二抗，ECL發光試劑顯影，分析條帶灰度值。

1.9 統計學方法 使用SPSS22.0統計軟件。計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析或重復測量方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各細胞中miR-195表達比較 mi R-195在U2932、HBL1、OCI-LY-10及IM-9中的相對表達量分別為0.51±0.15、0.38±0.10、0.27±0.11、1.02±0.04，與IM-9相比，miR-195在U2932、HBL1、OCI-LY-10中表達降低（P均＜0.05），且在OCI-LY-1中最低。

2.2 兩組OCI-LY-10細胞中miR-195表達比較 miR-195 mimics組、NC-mimics組中miR-195的相對表達量分別為8.58±0.40、1.02±0.08，兩組比較P＜0.05。

2.3 兩組OCI-LY-10細胞增殖活性和凋亡率比較 miR-195 mimics組24、48、72、96 h時細胞增殖活性低于NC-mimics組（P均＜0.05），見表1。miR-195 mimics組、NC-mimics組細胞凋亡率分別為（32.65±4.40）%、（6.41±1.33）%，兩組比較P＜0.05。

表1 兩組OCI-LY-10細胞增殖活性比較（xˉ±s）

2.4 兩組OCI-LY-10細胞侵襲和遷移能力比較 miR-195 mimics組、NC-mimics組侵襲細胞數分別為（81±26）、（206±56）個，遷移細胞數分別為（126±39）、（383±77）個，兩組比較P均＜0.05。

2.5 兩組OCI-LY-10細胞中HMGA2蛋白表達比較 miR-195 mimics組、NC-mimics組HMGA2蛋白相對表達量分別為0.21±0.09、0.92±0.18，兩組比較P＜0.05。

3 討論

DLBCL是一種具有明顯分子和臨床異質性的侵襲性疾病。盡管其治療有了顯著進展，但患者預后仍不能令人滿意［2］。克服原發性耐藥和提高藥物療效是目前DLBCL治療的挑戰。DLBCL的發病機制復雜，涉及不同的遺傳和表觀遺傳變化。目前，基于miRNA的分子靶向治療成為DLBCL治療的新策略。DUE等［12］發現，DLBCL中miR-155的高表達與長春新堿敏感性關系密切，并且miR-155高表達與DLBCL患者的臨床預后改善有關。SUN等［13］發現，miR-222能夠激活DLBCL細胞并促進細胞的增殖和侵襲。miR-23a［14］、miR-101［15］、mi R-26a［16］等許多miRNA被發現與DLBCL細胞的惡性表型有關，但至今尚未發現在DLBCL發生發展、耐藥過程中起決定性作用的miRNA。

近年來，眾多研究發現miR-195與腫瘤的形成有關，并在細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲中起關鍵作用［7-10］。然而，miR-195在DLBCL中的作用及其機制尚不清楚。既往研究報道DLBCL患者腫瘤組織中miR-195表達降低［11］，本研究發現DLBCL細胞中miR-195表達也降低，提示miR-195的異常低表達可能與DLBCL的發生發展有關。抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移，促進其凋亡是控制腫瘤的有效手段。本研究選擇miR-195表達最低的OCI-LY-10細胞作為研究對象，通過轉染miR-195mimics提高了細胞中mi R-195的表達，CCK-8實驗、流式細胞術和Transwell實驗發現，miR-195 mimics組較NC-mimics組細胞增殖活性、侵襲和遷移能力下降，而細胞凋亡率升高，提示上調miR-195能夠抑制DLBCL的惡性分子生物學行為。

研究顯示，miRNA在機體中發揮的作用與其對下游靶基因的調控有關。在肝細胞癌［17］、食管癌［18］、肺癌［19］中均發現mi R-195能夠通過靶向調控HMGA2的表達參與腫瘤的形成發展。HMGA2是目前研究較多的高遷移率族蛋白超家族成員，是在眾多惡性腫瘤中異常高表達的關鍵性轉錄調控因子，被認為是重要的癌基因［20］。研究證實，HMGA2能夠促進DLBCL細胞的增殖、侵襲和遷移［21］。本研究也發現DLBCL細胞中HMGA2蛋白的表達異常升高，上調OCI-LY-10細胞中miR-195表達能夠明顯抑制細胞中HMGA2蛋白的表達，提示miR-195在DLBCL發生進展中的作用可能與其對HMGA2蛋白的調控有關。

總之，miR-195在DLBCL細胞中呈低表達；上調DLBCL細胞中miR-195的表達可以抑制細胞的增殖、侵襲和遷移，增加細胞的凋亡，其機制可能與miR-195對HMGA2的靶向調控有關。