2型糖尿病腎病患者血清miR-92b-5p和HMGB1水平變化及臨床意義

陳晨，李晶，葉婷，李惠

新疆醫科大學附屬中醫醫院，烏魯木齊 830000

2017年全球約有4.51億糖尿病患者，預計到2045年，糖尿病患者人數將增加到6.93億，同時，接近一半（49.7%）的糖尿病患者未得到診斷［1］。糖尿病腎病是糖尿病常見且嚴重的并發癥之一，主要為腎小球和腎小管微血管病變，主要表現為持續性蛋白尿和腎小球濾過率進行性下降［2］。研究發現，miR-92b-3p可通過靶向糖尿病腎病大鼠中的Smad7介導晚期糖基化終產物（RAGE）誘導的腎臟異常發育［3］。而同屬于miR-92b家族的miR-92b-5p最早被發現與心房顫動和心衰等心臟疾病關系密切［4］，但有關糖尿病腎病患者miR-92b-5p表達情況及其與糖尿病腎病發病的關系目前尚未闡明。高遷移率族蛋白Box1（HMGB1）是一種分布在腎臟等重要器官高度保守的非組蛋白核蛋白，其作為促炎細胞因子，可通過激活Toll樣受體（TLR）2、TLR4或RAGE而介導多種炎性疾病的發生和發展［5-6］。HMGB1通過介導RAGE的產生和增加NF-κB的激活而誘發糖尿病大鼠的腎臟損傷［7］，因此阻斷HMGB1及其受體之間相互作用可預防糖尿病腎病的發展。鑒于此，本研究旨在探討血清中miR-92b-5p及HMGB1在糖尿病腎病發生發展過程中的作用，并分析其對糖尿病腎病的診斷及預測價值，為糖尿病腎病的診斷及治療提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1—12月及2020年4—7月于我院就診的203例2型糖尿病患者為研究對象，其中男92例、女111例，年齡26～80（62.44±10.81）歲，依據是否合并腎病將患者分為單純糖尿病組（n=98）和糖尿病腎病組（n=105），并納入80例同期體檢健康者為對照組，其中男41例、女39例，年齡（63.10±10.80）歲。納入標準：2型糖尿病患者符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》［8］中的診斷標準；2型糖尿病腎病的診斷根據《糖尿病腎病防治專家共識（2014年版）》［9］符合以下兩者之一即可：①糖尿病視網膜病變伴任何一期慢性腎臟病，②白蛋白尿；受試者年齡在18～80歲。排除標準：其他類型糖尿病或合并原發性或其他繼發性腎臟病；近期患急性感染性疾病；近期應用糖皮質激素或免疫抑制劑；合并惡性腫瘤等其他嚴重疾病；有透析史或腎移植病史。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 一般情況及常規檢驗指標收集 完整記錄各組年齡、性別、高血壓史、BMI、飲酒史、吸煙史，并記錄入院時的實驗室常規化驗指標，包括膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白（24 hpro）、肌酐，計算估算腎小球濾過率（eGFR）=［（140-年齡）×體質量（kg）×88.4］/［72×肌酐（mmol/L）］（女性×0.85）。

1.3 血清miR-92b-5p和HMGB1檢測 采集所有受試者空腹血9 mL，加入EDTA管中，血清的分離工作于4 h內完成，以4℃3 000 r/min（離心半徑8 cm），離心15 min，分離血清，后將其轉移至無RNA酶及DNA酶的EP管中，并存于-80℃冰箱備用。HMGB1采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測，ELISA試劑盒購自武漢優爾生科技公司，依照提供的說明書完成檢測。采用實時熒光定量PCR法檢測miR-92b-5p mRNA：將血清從-80℃冰箱取出置于冰上解凍，采用TRIzol裂解液（Invitrogen公司，美國）對血清提取總RNA，之后采用cDNA逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）將提取出的總RNA按500 ng體系（反應條件為37℃15 min、85℃5 s），逆轉錄為cDNA；取1μL cDNA、10μL SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司，日本）和1μL miR-92b-5p特異性引物按20μL體系，使用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系統（Thermo Fisher，新加坡）進行擴增。miR-92b-5p的循環條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個循環。miR-92b-5p上游引物序列為5'-AGGGACGGGACGCGGTGCAGTG-3'，下游引物序列為5'-GCGAFCACAGAATTAATACGAC-3'；內參基因U6上游引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。每個樣品重復3次上樣，采用2-ΔΔCt法測定miR-92b-5p的相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。計量資料以±s表示（經正態性檢驗并符合正態分布時），兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例（%）表示，多組間比較采用χ2檢驗；相關因素分析采用多因素Logistic回歸分析；預測價值根據繪制的ROC曲線進行分析，采用Pearson檢驗進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床特征比較 見表1。

表1 各組臨床特征比較

2.2 2型糖尿病患者進展為糖尿病腎病的危險因素分析 將表1中具有統計學差異的指標進行多因素Logistic回歸分析（α入=0.05，α出=0.10），以是否合并腎病為因變量，以HbA1c、FBG、24 hpro、eGFR、肌酐、miR-92b-5p及HMGB1水平為自變量。結果顯示，HMGB1和24 hpro水平升高與miR-92b-5p和eGFR水平降低均是2型糖尿病患者進展為糖尿病腎病的獨立危險因素（P均＜0.05），見表2。

表2 2型糖尿病患者是否合并腎病的危險因素分析

2.3 2型糖尿病患者血清miR-92b-5p、HMGB1與24 hpro、eGFR的相關性 2型糖尿病患者血清mi R-92b-5p水平與HMGB1（r=-0.297）和24 hpro（r=-0.388）水平均呈負相關，miR-92b-5p與eGFR（r=0.406）水平呈正相關；HMGB1和24 hpro（r=0.573）水平均呈正相關，與eGFR（r=-0.601）水平呈負相關（P均＜0.05）。

2.4 血清miR-92b-5p和HMGB1對2型糖尿病腎病的預測價值 根據ROC曲線分析結果，miR-92b-5p對應的最佳診斷閾值為2.967，敏感性為82.9%、特異性為63.7%；HMGB1對應的最佳診斷閾值為72.08μg/L，敏感性為72.4%，特異性為90.8%；二者聯合對2型糖尿病患者進展為糖尿病腎病的預測價值均高于miR-92b-5p（Z=2.208，P=0.027）或HMGB1（Z=2.327，P=0.030）單一檢測，見表3。

表3 血清miR-92b-5p和HMGB1對2型糖尿病腎病的預測價值

3 討論

隨著肥胖患者數量的增加，2型糖尿病的患病率在全球范圍內呈上升趨勢，大約25%的2型糖尿病患者可進展為糖尿病腎病，其是終末期腎病的主要原因［10］。糖尿病腎病的常見病理特征包括細胞外基質蛋白聚集，系膜細胞增生、肥大以及腎小球足細胞功能障礙［6］。糖尿病腎病發病機制較為復雜且缺乏有效的診斷方法，常規檢測手段存在一定的局限性，例如目前臨床對糖尿病腎病的診斷和監測試驗包括尿白蛋白和eGFR，但在蛋白尿發生之前約有三分之一的患者腎功能下降，因此單獨檢測蛋白尿不足以監測糖尿病腎病的發生和發展［11］，故尋找新的糖尿病腎病診斷性標志物或發病的危險因素，并進行早期識別和治療對防治糖尿病腎病至關重要。

miRNA通過識別靶基因的3′-UTR而誘導靶基因的降解，可抑制蛋白質翻譯過程，調節多種生理反應及病理過程。既往研究發現miRNA可參與調節機體的生長與分化、炎癥反應、氧化應激、血管生成等，與炎癥、內分泌疾病等多種疾病關系密切［12］。而miRNA對機體的病理生理變化反應靈敏且性質穩定，提示其可作為疾病診斷及預后評估的新型標志物［12］。近期研究發現miR-92b在腎臟多種病理生理過程中發揮作用，例如其可靶向調控水通道蛋白2而減輕腎水腫［13］，miR-92b-5p最早在心房顫動和心衰等心臟疾病中被發現，而在脊髓損傷模型中發現miR-92b-5p表達水平與IL-18結合蛋白的表達相關，繼而通過調控IL-18來介導炎癥反應［14］。IL-18在腎組織中表達，并在包括高血糖在內的多種刺激下上調。而炎癥反應可直接破壞腎臟結構，在糖尿病腎病的病理生理過程中起重要作用，其中IL-18較IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α和巨噬細胞趨化蛋白-1等其他炎性因子在糖尿病腎病發病中所起作用更具特異性，IL-18表達與糖尿病腎病的進展及尿白蛋白排泄率呈正相關［15］。因此我們推測miR-92b-5p與糖尿病腎病的發病可能存在相關性。HMGB1是一種作為基因表達輔助因子的核蛋白，幾乎在所有細胞類型中普遍存在。在細胞核中HMGB1通過以非特異性序列方式結合DNA來支持染色質的結構，并參與基因的轉錄調控、DNA修復和細胞分化等多種生物學功能，其主要細胞受體是RAGE，而RAGE在包括心臟、腎臟、大腦、嗜中性粒細胞、淋巴細胞等多種組織和細胞中均有表達，HMGB1通過與RAGE結合而發揮促炎、促進細胞遷移和侵襲等多種生物學作用［6］。HMGB1表達升高可激活如CDC42/Rac、MAPK/NF-κB等炎癥信號通路而加重腎臟的炎癥反應，導致炎性細胞浸潤程度升高［16］；研究表明，高血糖可誘導HMGB1從活化的腎細胞中釋放并刺激RAGE受體和TLR4而發揮促炎作用，引起腎小管間質炎癥而導致腎損傷，最終導致糖尿病腎病的發生［17-18］。上述研究提示，糖尿病患者mi R-92b-5p水平降低及HMGB1表達升高誘發的炎癥反應可能在糖尿病腎病發病過程中發揮重要作用。

本研究結果顯示，2型糖尿病腎病患者的HMGB1水平高于單純糖尿病患者和體檢健康者，而mi R-92b-5p水平低于單純糖尿病患者和體檢健康者。進一步Logistic回歸分析發現，2型糖尿病患者HMGB1水平升高與mi R-92b-5p水平降低是其進展為糖尿病腎病的危險因素。既往研究發現在糖尿病發生時，HMGB1由受損腎組織釋放并在腎細胞胞質中高表達，且HMGB1水平高低與腎臟炎癥和氧化應激水平成正相關，升高的HMGB1可激活MAPK/NF-κB、TLR等多種炎癥信號通路共同參與糖尿病腎病炎性損傷的發病機制［7，16，19］。研究發現在大鼠糖尿病腎病模型中，miR-92b-5p表達降低而HMGB1表達升高，模型鼠24 hpro、尿素氮和血清肌酐水平均升高，HE染色觀察到腎小球系膜和基底膜小管炎性細胞的浸潤程度明顯升高并伴明顯的增生和腫脹，進而該研究發現過表達miR-92b-5p可顯著抑制含有野生型HMGB1質粒的螢光素酶活性，提示miR-92b-5p表達升高可靶向下調HMGB1的表達［20］，因此當miR-92b-5p表達降低時可靶向上調HMGB1的表達，繼而激活與HMGB1相關的炎癥反應信號通路，參與糖尿病腎病的發生與發展。同時本研究相關性分析發現miR-92b-5p與HMGB1水平呈負相關，且mi R-92b-5p、HMGB1與24 hpro、eGFR均有一定的相關性，說明miR-92b-5p降低導致HMGB1水平升高可能通過導致腎小球系膜和基底膜小管炎性細胞的浸潤程度升高繼而導致基底膜小管和腎小球系膜增生和腫脹，最終導致尿白蛋白的升高和腎小球濾過率的下降。進一步ROC曲線結果顯示血清miR-92b-5p和HMGB1水平對2型糖尿病患者進展為糖尿病腎病有一定的預測價值，且二者聯合對2型糖尿病進展為糖尿病腎病的預測價值高于單獨檢測，提示早期聯合檢測兩指標可作為臨床預測2型糖尿病腎病發生及進展的標志物。

綜上所述，血清HMGB1水平升高和miR-92b-5p水平降低是2型糖尿病向糖尿病腎病進展的危險因素，早期聯合檢測兩指標可作為輔助預測2型糖尿病腎病發生的標志物。但本研究為單中心、小樣本研究，需擴大樣本量并開展多中心研究進一步驗證研究結果。