胰島素樣生長因子1受體α亞單位基因重組真核表達質粒的構建

吳蕊辛，鄭薇，李寧，芮忠穎，周雅倩，王萱

天津醫科大學總醫院，天津 300052

Graves病是自身免疫性甲狀腺病最常見的類型［1］。Graves眼病（GO）是Graves病最常見的甲狀腺外表現［2］，通常累及眼球后脂肪、眼外肌等，從而造成眼部炎癥、組織腫脹和纖維變性。目前研究認為，促甲狀腺素受體抗體（TRAb）在Graves病及GO的發病過程中起重要作用。近年有研究報道，GO患者眼眶成纖維細胞中胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）高表達，IGF-1R是GO的致病抗原之一［3-4］。胰島素樣生長因子1（IGF-1）通過與IGF-1R結合刺激GO患者眼眶成纖維細胞分泌透明質酸，與增多的脂肪細胞共同參與GO的發生發展，IGF-1R是GO患者眼眶成纖維細胞增殖的重要始動因素［5-6］。本課題組前期通過轉染促甲狀腺激素受體（TSHR）α亞單位重組質粒成功誘導出Graves病小鼠模型［7-8］，鑒于IGF-1R在GO發病過程中的重要作用，本研究擬構建IGF-1R重組真核表達質粒，為誘導Graves病伴GO動物模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIzol試劑購自美國Gibco公司，RTPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，限制性內切酶BamHⅠ、ScaⅠ、HindⅢ購自美國NEB公司，質粒提取試劑盒、DNA Marker、DNA純化試劑盒購自北京天為時代科技有限公司，E.coli TOP10和pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO購自美國Invitrogen公司，上下游引物合成及DNA測序由上海生工生物技術公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據美國國立生物技術信息中心（NCBI）公布的人IGF-1R基因編碼序列（NM_000875.5）和pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO質粒載體信息，設計擴增IGF-1Rα亞單位引物，并在上游引物5'-端增加CACC拓撲克隆位點，保證克隆方向正確性和提高克隆效率。上游引物序列：5'-CACCATGAAGTCTGGCTCCG-3'，下游引物序列：5'-TAGCTTGGCCCCTCCATACT-3'，擴增產物長度2 679 bp。

1.2.2 甲狀腺組織總RNA提取 收集來自天津醫科大學總醫院甲狀腺外科Graves病患者手術切除的新鮮甲狀腺組織，采用TRIzol一步法提取總RNA。取組織標本約50 mg，在放有液氮的研缽中研成粉末后移入加有1 mL試劑的冰浴的玻璃勻漿器中，冰浴下勻漿5 min。勻漿液移入1.5 mL離心管中，25℃水浴5 min，加入0.2 mL三氯甲烷劇烈振蕩15 s，25℃水浴3 min，4℃12 000 g離心15 min。吸取上層水相加等量異丙醇，混勻，25℃水浴10 min，4℃12 000 g離心15 min。棄上清，RNA沉淀中加入由DEPC處理的水配制的75%乙醇1 mL，旋轉混勻，4℃7 500 g離心5 min，棄去上清液。將RNA沉淀自然涼干，加入DEPC處理的水60μL，55℃溫浴10 min溶解RNA。利用紫外—可見光分光光度計測定RNA純度和濃度，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1.2.3 逆轉錄合成甲狀腺cDNA 以500 ng總RNA為模板，用Oligo（dT）為引物，按照逆轉錄試劑盒說明制備cDNA。

1.2.4 IGF-1Rα亞單位基因PCR擴增 用Taq Platinum聚合酶擴增IGF-1Rα亞單位基因片段。PCR反應體系：上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，cDNA 1.5μL，2×MasterMix 12.5μL，去離子水9.0μL，總反應體積25μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性45 s，63℃退火1 min，72℃延伸45 s，共35個循環，最后72℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像儀上觀察分析擴增結果，切取含目的片段（2 679 bp）的凝膠，以DNA純化試劑盒回收純化目的片段用于與載體連接。

1.2.5 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO真核表達質粒的構建 用新鮮的IGF-1Rα亞單位基因PCR回收產物與pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO載體（5 514 bp）進行拓撲克隆連接。將PCR回收產物1μL、TOPO vector 1μL、反應緩沖液1μL、超純水3μL輕柔混合，室溫（22～23℃）孵育30 min。取4μL混合物與E.coli One Shot?TOP10（50μL）感受態細胞混合，冰浴30 min。將混合物置于42℃的水浴中熱休克30 s，使混合物立即冷卻，加入250μL SOC培養基，放入空氣浴振蕩器，37℃200 r/min 30 min。取100μL反應物鋪于含氨芐青霉素100μg/mL的LB培養板上，37℃培養過夜后觀察菌落生長情況。

1.2.6 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO真核表達質粒的鑒定 次日從培養板中隨機挑取3個陽性單克隆菌落（命名為1號、6號、8號），分別接種于5 mL LB液體培養基中，加入5μL 1 mg/mL的氨芐青霉素，混勻，37℃200 r/min振蕩培養過夜。按照質粒提取試劑盒說明書提取IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒，以其為模板進行PCR擴增（反應條件同前）鑒定。用限制性內切酶HindⅢ或BamHⅠ分別消化重組質粒，IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒0.5μL（1μg/μL），10×HindⅢ或BamHⅠ酶切緩沖液3μL，再加HindⅢ或BamHⅠ1μL（10 U/μL），以超純水補充體積至30μL，37℃消化2 h，產物行1%瓊脂糖凝膠電泳。先用限制性內切酶BamHⅠ消化IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒，反應條件同前，行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切產物。再用ScaⅠ消化上述酶切產物，酶切產物5μL，10×ScaⅠ酶切緩沖液3μL，ScaⅠ1μL（10 U/μL），以超純水補充體積至30μL，37℃消化2 h，產物行1%瓊脂糖凝膠電泳。經PCR驗證和限制性內切酶酶切鑒定陽性的重組質粒分別以T7正向引物和BGH反向引物為測序引物進一步做測序分析，并與目的基因序列進行比對驗證。

2 結果

2.1 Graves病患者甲狀腺組織總RNA純度、完整性測定結果 Graves病患者甲狀腺組織中總RNA OD260/OD280為1.8～2.0，純度較好。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA 28 s、18 s大小亞基結構完整，結果見圖1。

圖1 Graves病患者甲狀腺組織中總RNA 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 IGF-1Rα亞單位基因PCR擴增結果 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產物在約2 600 bp處可見一條清晰、特異的條帶，與目的基因片段長度2 679 bp基本吻合，見圖2。

2.3 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒的鑒定結果 含有IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒的單克隆菌落見圖3。以該重組質粒為模板PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約2 600 bp處可見清晰、特異的目的條帶，初步證實重組質粒中含有IGF-1Rα亞單位目的基因（2 679 bp）片段，見圖4。

圖2 IGF-1Rα亞單位基因PCR產物電泳圖

圖3 轉化IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒的大腸桿菌陽性菌落

圖4 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒PCR擴增產物電泳圖

重組質粒經單酶切（HindⅢ或BamHⅠ），分別產生約8 100 bp單一特異產物，與IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒（8 193 bp）大小一致，見圖5。經雙酶切（BamHⅠ和ScaⅠ），產生約250 bp和7 900 bp兩條特異產物條帶，與預期結果265 bp和7 928 bp相符，見圖5。重組質粒酶切結果證明，篩選出的陽性菌落中含有IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒。

圖5 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒酶切鑒定電泳圖

經比對，插入的目的片段序列與NCBI公布的人IGF-1Rα亞單位基因編碼序列（NM_000875.5）完全一致，接口序列與Invitrogen公司的pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO載體一致，讀碼框架正確。證明IGF-1Rα亞單位目的基因片段已成功插入表達載體，IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO真核重組表達質粒構建成功。

3 討論

GO是Graves病最常見的甲狀腺外表現，25%～50%的Graves病患者會發展為GO，其表現為因眶內結締組織和脂肪組織擴張而出現眼球突出等臨床癥狀［9］。GO的發病機制目前尚不明確，1986年人們首次在大鼠甲狀腺細胞中發現促甲狀腺激素（TSH）和IGF-1信號通路間存在聯系［10］。2008年TSUI等［11］通過比較GO患者和健康對照者眼眶成纖維細胞和甲狀腺細胞表面IGF-1R、TSHR水平，發現TSHR、IGF-1R之間存在物理和功能上的共定位現象，TSHR、IGF-1R在甲狀腺和眼眶組織中可能共同構成一個功能復合體。TSHR和IGF-1R是導致GO患者眼眶成纖維細胞增殖的重要因素［5-12］。

關于Graves病動物模型的研究已有30余年，但至今尚未制備出比較理想的Graves病伴GO的動物模型。2013年MOSHKELGOSHA等［13］用TSHRα亞單位基因重組腺病毒免疫小鼠產生TRAb而誘導出Graves病模型，部分模型小鼠出現眼眶腫脹充血、單側或雙側眼球突出，大部分小鼠眼外肌增粗，有些小鼠出現球后脂肪組織増多，球后肌纖維黏多糖沉積及CD3+T細胞、巨噬細胞和肥大細胞眶內浸潤，眼眶部位MRI成像顯示眼眶肌增粗和周圍脂肪增多等，但小鼠血清TRAb大部分為促甲狀腺素受體阻斷性抗體（TSBAb），甲狀腺組織病理學表現為甲狀腺功能減退。2017年XIA等［14］報道，在約30%Graves病小鼠中觀察到眼裂增寬、眼部MRI顯示眼外肌增大、眼外肌T淋巴細胞浸潤（約50%）及透明質酸聚集（約30%），但未見明顯眼球突出和球后脂肪增多。

隨著對GO發病機制認識的不斷深入，IGF-1R作為GO的重要致病抗原，逐漸成為GO發病機制的研究熱點分子［12］。IGF-1R是一種酪氨酸激酶受體家族跨膜受體，由2個α亞基和2個β亞基組成，α亞基（殘基1-707）完全位于胞外且與配體結合，是IGF-1R與IGF-1結合的主要部位，β亞基（殘基712-1337）是包括細胞內酪氨酸激酶結構域的跨膜結構［15-16］。配體IGF-1與IGF-1Rα亞基的結合會誘導受體的構象變化，導致β亞基的激酶催化C結構域中的三個酪氨酸殘基發生自磷酸化，活化下游信號傳導通路［17］，因此IGF-1Rα亞單位是IGF-1R發揮生物學功能的核心區域，在GO的發生發展中起關鍵作用。

本研究設計構建IGF-1Rα亞單位重組真核表達質粒用于誘導Graves病伴GO小鼠模型是基于以下兩點考慮：第一，IGF-1Rα亞單位在GO的發生發展中起著獨特作用，目前罕見應用IGF-1Rα亞單位基因誘導GO模型的成功報道；第二，相較于IGF-1R基因全長，α亞單位基因片段更小，有利于通過電穿孔將重組質粒轉染動物，轉染效率高，更易誘導出GO動物模型。根據人類蛋白質圖譜公布的人體各類組織中IGF-1R水平分布情況可知，性腺、小腦、胰腺、甲狀腺等組織中IGF-1R高表達，考慮組織獲得的難易程度和體積大小，最終選擇從甲狀腺外科切除術中獲得Graves病患者的新鮮甲狀腺組織，采用TRIzol一步法提取總RNA。根據NCBI公布的人IGF-1R基因編碼序列和pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO質粒載體信息設計了多對引物作為候選。自身配對較多的引物會導致PCR產生非特異性擴增，引物GC含量過高會導致擴增困難，因此本研究選定自身互補配對數小于5且GC含量小于60%的引物作為特異性的擴增引物，運用RT-PCR技術擴增出IGF-1Rα亞單位mRNA編碼序列，其長度為2 679 bp，編碼893個氨基酸。此外，引物設計時還考慮到載體5'-末端懸掛四個堿基GTGG，在上游引物加5'-端CACC，這樣既可以保證拓撲克隆方向正確，又可以提高連接效率（正確率大于90%），大大減少了后續重組質粒鑒定的工作量。

綜上所述，本研究成功構建了IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組真核表達質粒，為誘導Graves病伴GO動物模型研究奠定了基礎。