類球紅細菌對亞硝酸鹽和食鹽及pH的耐受性研究

趙志平，唐闊，吉莉莉，陳林，韓煦，王衛*

(1.成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106；2.四川輕化工大學 化學工程學院，四川 自貢 643000)

腌臘肉制品具有風味獨特、加工簡單、貯藏期長等特點，深受消費者的喜愛。但腌臘肉制品在加工過程中需要添加亞硝酸鹽，對產品的安全帶來一定的隱患[1]。消除腌臘肉制品中亞硝酸鹽影響的途徑較多，如降低亞硝酸鹽的使用量、使用亞硝酸鹽替代物和利用微生物發酵劑等。李玉邯等利用胡蘿卜粉替代亞硝酸鹽制作了香腸，結果表明添加0.4%胡蘿卜粉替代亞硝酸鹽，并添加一定的抗氧化劑，可制作出品質較好且亞硝酸鹽含量低的香腸[2]。何丹等利用天然植物提取物替代亞硝酸鹽加工了中式培根，產品冷藏至25 d時仍然呈現出良好的質量特性[3]。將添加量為0.1%的天然提取復合物(茶多酚、葡萄籽提取物、番茄紅素和維生素E按25∶20∶20∶16比例組合)添加到香腸中，其抑菌效果優于亞硝酸鹽[4]。

微生物發酵劑除了可以降低腌臘肉制品中亞硝酸鹽的殘留，還可以改善產品的品質。阮一凡等以鴨腿為原料，利用植物乳桿菌和釀酒酵母菌作為發酵劑制作了發酵鴨腿，發現混合發酵劑能夠提升產品的口感，并且隨著貯藏期的延長，發酵劑能顯著抑制產品感官的劣變和脂肪氧化以及不良生物胺的產生[5]。王衛等研究發現，微生物發酵劑能夠加快風味羊腿的發酵進程，顯著抑制脂肪氧化和降低亞硝酸鹽殘留[6]。杜寶等以巴盟羊肉為原料，添加混合發酵劑制作了發酵香腸，結果發現貯藏階段發酵劑組香腸的亞硝酸鹽殘留量為7.993 mg/kg，顯著低于對照組的12.493 mg/kg；發酵劑組香腸的TBARS值為0.215 mg/kg，顯著低于對照組的0.565 mg/kg[7]。

類球紅細菌富含類胡蘿卜素、輔酶Q10等天然抗氧化活性物質[8-9]，在食品領域有重要的應用。亞硝酸鹽、食鹽是加工腌臘肉制品必需的添加劑和輔料，同時肉類的pH呈弱酸性。為探討類球紅細菌在腌臘肉制品中應用的可行性，本研究分析了類球紅細菌對亞硝酸鹽、食鹽和低pH的耐受性，為類球紅細菌在腌臘肉制品中的應用提供了初步的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

類球紅細菌Rhodobactersphaeroides2.4.1：本實驗室保存。

1.2 主要儀器

YP302N型電子天平 上海菁海儀器有限公司；PHS-3C-01型pH計 上海三信儀表廠；水浴恒溫振蕩器 金壇市金南儀器制造有限公司；HC-2518型臺式高速離心機 湘儀設備有限公司；UV-1801型紫外可見分光光度計 北京北分瑞利有限公司；EPED-E2-10TJ型超純水機 四川優普超純科技有限公司；756PC型生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DHP-9160B通用型超凈工作臺 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 類球紅細菌的活化與微氧培養

1.3.2 類球紅細菌對亞硝酸鹽的耐受性分析及生長曲線繪制

1.3.3 類球紅細菌在亞硝酸鹽脅迫下的生長曲線

1.3.4 類球紅細菌對食鹽的耐受性分析

1.3.5 類球紅細菌在食鹽脅迫下的生長曲線

1.3.6 類球紅細菌對低pH值的耐受分析

1.3.7 類球紅細菌在低pH值下的生長曲線

1.3.8 類球紅細菌在亞硝酸鹽、食鹽和低pH同時脅迫下的生長曲線

2 結果與分析

2.1 類球紅細菌對亞硝酸鹽的耐受性

亞硝酸鹽是腌臘肉制品加工中常用的食品添加劑，具有抑菌、抗氧化等重要作用[12]，從而提高腌臘肉制品的品質和延長貨架期。類球紅細菌對亞硝酸鹽有一定的耐受性，結果見圖1。

圖1 類球紅細菌對亞硝酸鹽的耐受性分析

由圖1可知，隨著亞硝酸鹽濃度的增加，類球紅細菌生長得越來越慢。與對照組(亞硝酸鹽濃度為0 mg/kg)相比，25 mg/kg的亞硝酸鹽對類球紅細菌的生長沒有顯著的影響，表明類球紅細菌對25 mg/kg的亞硝酸鹽有良好的耐受性。亞硝酸鹽濃度為50，75，100，150 mg/kg時，類球紅細菌的生長速度顯著慢于對照組，但50，75，100 mg/kg脅迫的類球紅細菌在相同的時間內仍然達到了對數生長期。

100 mg/kg是腌臘肉制品中常使用的亞硝酸鹽濃度，為進一步研究亞硝酸鹽對類球紅細菌生長影響的規律，特繪制了100 mg/kg亞硝酸鹽脅迫時類球紅細菌細菌的生長曲線，結果見圖2。

圖2 類球紅細菌在100 mg/kg亞硝酸鹽下的生長曲線

由圖2可知，沒有亞硝酸鹽脅迫的對照組達到穩定期的時間明顯比添加100 mg/kg亞硝酸鹽的實驗組短，表明對照組菌的生長速度明顯快于樣品組。對數后期實驗組仍可達到和對照組幾乎一樣的菌落數，說明在亞硝酸鹽脅迫的情況下，類球紅細菌仍具有較好的生長性能。亞硝酸鹽還原酶對類球紅細菌耐受和降解亞硝酸鹽發揮著決定性作用[13]，但本研究所用的類球紅細菌Rhodobactersphaeroides2.4.1基因組中不含有亞硝酸鹽還原酶基因，說明該類球紅細菌通過其他途徑降解亞硝酸鹽。此外，類球紅細菌在100 mg/kg亞硝酸鈉脅迫下的生長速度明顯變慢，表明類球紅細菌降解亞硝酸鹽的能力較弱，后期需要通過馴化和改造進一步提高其降解亞硝酸鹽的能力，為發酵劑的開發提供條件。

2.2 類球紅細菌對食鹽的耐受性分析

一定濃度的食鹽能夠抑制微生物的生長，但某些微生物卻能依靠自身的調控存活于一定濃度的鹽水中，表現出較好的耐受性，耐受食鹽是微生物發酵劑在腌臘肉制品中應用的前提之一。

由圖3可知，隨著食鹽含量的遞增，類球紅細菌培養液在660 nm處的吸光值依次減小，并且隨著食鹽含量逐漸增加，耐受性逐漸減弱。在食鹽濃度為2.0%時，類球紅細菌的生長雖然受到顯著性抑制，但OD660仍然在1.0以上，表現出良好的生長特性。類球紅細菌對食鹽有一定的耐受性，并且6S RNA和外膜蛋白SspA對耐受食鹽脅迫發揮著重要作用[14-15]。在食鹽脅迫條件下，類球紅細菌的轉錄組、相容性溶質和膜脂都會發生相應的變化[16]。未來隨著腌臘肉制品低鹽化，為類球紅細菌在腌臘肉制品中的應用創造了有利條件。

圖3 類球紅細菌在不同食鹽含量下的生長

由圖4可知，與對照相比，2.5%食鹽脅迫下類球紅細菌的生長速率變慢，菌體密度有所下降，在穩定期的峰值也較低，生長周期延長，2.5%食鹽顯著抑制了其生長。但在脅迫條件下，類球紅細菌在穩定期的OD660達到了1.12左右，表現出一定適應性。

圖4 類球紅細菌在2.5%食鹽脅迫下的生長曲線

2.3 類球紅細菌對pH的耐受性分析

發酵食品在發酵成熟的過程中，由于乳酸菌發酵產酸，食品pH會逐漸降低，抑制有害微生物的生長。pH會影響與菌體生長代謝有關的酶促反應，進而影響發酵的效果，所以發酵劑的耐酸性至關重要。

由圖5可知，隨著pH的逐漸下降，類球紅細菌的生長速度呈現出先升后降的趨勢。6.9是類球紅細菌正常培養基的pH值，在pH為6.3和6.1時，類球紅細菌的生長速度變快但沒有顯著性差異。pH值繼續下降時，類球紅細菌的生長變慢，但pH值為5.9時與對照組比沒有顯著性差異，表明類球紅細菌對pH具有較好的耐受性。pH值為5.7時，與對照組相比顯示出顯著性差異(P<0.05)。pH值為5.5時，類球紅細菌不能正常生長。pH對類球紅細菌生長的影響與于翠芳等關于pH對金黃色葡萄球菌的影響類似[17]。

圖5 類球紅細菌在不同pH時的生長

將培養基的初始pH調整為5.8，其他條件不變，探究類球紅細菌在pH 5.8時的生長情況。

由圖6可知，與對照組相比，類球紅細菌在pH 5.8環境下的生長情況與pH 6.9幾乎重合，表明類球紅細菌在pH 5.8時能正常生長。

圖6 類球紅細菌在pH 5.8和pH 6.9時的生長曲線

2.4 類球紅細菌在亞硝酸鹽、食鹽和低pH同時脅迫時的生長

與對照組相比，在亞硝酸鹽、食鹽和低pH共同脅迫下，類球紅細菌的延滯期相對延長，達到穩定期的速度變慢，菌體的密度整體下降，說明其生長受到抑制，見圖7。

圖7 類球紅細菌在亞硝酸鹽、食鹽和低pH同時脅迫下的生長曲線

由圖7可知，實驗組和對照組均能達到幾乎相同的峰值，綜合分析得出類球紅細菌能在同時含有100 mg/kg的亞硝酸鹽、2.5%的食鹽和pH 5.8的脅迫條件下較好地生長，說明類球紅細菌對亞硝酸鹽、食鹽和低pH脅迫具有一定的適應能力，為該菌在腌臘肉制品中的應用提供了初步的依據。

3 結論

本研究探索了類球紅細菌對亞硝酸鹽、食鹽和低pH的耐受性。結果顯示：類球紅細菌分別在100 mg/kg的亞硝酸鹽、2.5%的食鹽和pH 5.8的脅迫條件下能夠良好地生長，對亞硝酸鹽、食鹽和低pH展現出良好的耐受性。類球紅細菌在亞硝酸鹽、食鹽和低pH同時脅迫的情況下，生長速度變慢，但仍能達到幾乎相同的生長峰值。本研究為類球紅細菌在腌臘肉制品中的應用提供了初步的依據。