魚醬酸調味料中氨基酸含量分析

楊坤，吳凱儀，張建煬，顧陽，劉桂瓊，管春成

(黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556012)

魚醬酸調味料是貴州省黔東南州苗族地區原生態飲食的一種傳統發酵調味料食品，是以雷公山區域內溪流中魚扇子、爬巖魚等河魚和當地種植的鮮辣椒為主要原料，配以食鹽、生姜、白酒、醪糟、大米等輔料，采用傳統密閉發酵工藝釀制而成的一種新型半固態調味料[1-3]，其不僅富含大量人體必需的氨基酸、維生素等營養物質，而且具有提高食欲、健胃作用。氨基酸作為魚醬酸的重要營養指標之一，其組成和含量能夠在一定程度上反映魚醬酸的原材料來源和發酵程度，目前很少有研究報道魚醬酸調味料中氨基酸含量成分。因此，氨基酸含量成分的檢測對魚醬酸調味料的營養價值研究和質量控制具有十分重要的意義。

目前，氨基酸的分析方法包括柱后衍生-高效液相色譜法[4-9]、離子交換色譜法[10-11]和液相色譜串聯質譜法等[12-15]。其中以柱后衍生-高效液相色譜法技術研制的氨基酸分析儀已被廣泛應用于氨基酸分析，但其具有耗時長、檢出限高等缺點，超高效液相色譜-串聯質譜法因具有高靈敏度、高效快速和高通量等優點而成為最近幾年國內外分析氨基酸含量的熱點[16-18]。本研究基于UPLC-MS/MS技術，建立同時快速測定魚醬酸調味料中17種氨基酸的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

17種氨基酸混合標準溶液(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸含量均為1.00 μmol/mL)：壇墨質檢科技股份有限公司。

甲醇(色譜純)：德國Merck公司；甲酸(色譜純)、鹽酸(優級純)：國藥集團化學試劑有限公司；水為實驗室自制超純水；魚醬酸樣品：購于當地超市。

1.1.2 儀器

AB SCIEX API 4000+質譜聯用系統 美國AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity II型液相色譜儀 美國Agilent公司；Milli-Q純水機 美國Millipore公司；ML104電子天平 瑞士梅特勒-托利多(上海)儀器公司；3-18k型高速冷凍離心機 德國Sigma公司； KQ-700DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司。

1.2 標準系列工作溶液的配制

準確吸取1.00 μmol/mL氨基酸混合標準溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度為100 nmol/mL的儲備液溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用。

分別精密吸取不同體積的氨基酸儲備溶液，用水稀釋成不同濃度系列的混合標準溶液(質量濃度見表2)，然后進液相色譜-質譜儀分析測定，繪制峰面積與標準溶液濃度標準曲線。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

水解氨基酸：稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加30 mL水超聲40 min溶解，冷卻至室溫后定容至刻度，在6000 r/min下離心10 min，然后取適當溶液于25 mL容量瓶中加水定容至刻度，過0.22 μm水相濾膜，取續濾液上機。

酸水解氨基酸：稱取1.00 g樣品于20 mL水解管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮氣后蓋緊旋蓋，于110 ℃下酸解22 h后取出冷卻至室溫。轉移水解液至50 mL離心管中并用水多次沖洗水解管，用水定容至刻度，振蕩混勻，在6000 r/min下離心10 min，然后取適當溶液于25 mL容量瓶中加水定容至刻度，過0.22 μm水相濾膜，取續濾液上機。

1.3.2 分析條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流動相A為水溶液(含0.1%甲酸)，B為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序：0～1.50 min，1.0% B；1.50～2.00 min，20% B；2.00～3.00 min，80% B，3.00～4.90 min，80% B，4.90～5.00 min，1.0% B。后運行2.50 min，流速0.2 mL/min；進樣量2 μL；柱溫：30 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式，去溶劑溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：172 kPa；碰撞氣壓力：41 kPa；離子氣1壓力：414 kPa；離子氣2壓力：379 kPa；離子噴射電壓：5500 V；掃描方式：多反應監測(MRM)模式，其他質譜參數條件見表1。

表1 氨基酸的質譜分析參數

1.3.3 計算公式

采用標準曲線法計算氨基酸含量：

式中：X為式樣中氨基酸的含量，%；c為待測樣品各氨基酸的含量，nmol/mL；F為試樣稀釋倍數；V為試樣定容體積，mL；M為氨基酸分子質量；m為試樣質量，g；109為樣品含量換算系數。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

由于氨基酸分子含有氨基和羧基兩種官能團，其極性較大，本研究首先選擇了Waters ACQUITY UPLC BEH Hilic(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)兩根親水色譜柱考察其保留效果，研究發現部分氨基酸出現拖尾和分叉現象，原因可能是樣品溶液用水溶解導致在Hilic親水色譜模式下出現溶劑擴散效應。而大部分氨基酸在普通C18色譜柱上保留效果較差，樣品中大量的強極性干擾物質會干擾目標化合物，導致一定的基質效應。因此，本研究選擇對親水有較大保留效果的T3色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm，1.7 μm)進行分離，達到了較好的分離效果，其正離子多反應監測色譜圖見圖1。

圖1 17種氨基酸的MRM色譜圖

進一步對流動性的種類進行考察，當選擇乙腈作為有機相時，亮氨酸和異亮氨酸無法實現基線分離，甲醇為流動相時，亮氨酸和異亮氨酸能達到較好的分離，并且保留效果增強。選擇甲酸銨和乙酸銨作為水相時，部分氨基酸出現信號抑制現象。因此，選擇0.1%甲酸水溶液作為水相能確保17種氨基酸的靈敏度。

2.2 質譜條件優化

在離子源正離子模式下以流動注射方式對17種氨基酸進行母離子(Q1)全掃描，確定各目標化合物的母離子，再對母離子進行二級質譜掃描(MS2)，對錐孔電壓、碰撞能量等參數進行優化，每個化合物選擇2對響應值高的特征離子對作為定量及定性離子，丙氨酸和脯氨酸沒有找到合適的第2對特征離子，優化后的質譜參數見表1。

2.3 方法學評價

在優化的UPLC-MS/MS分析條件下，17種氨基酸在一定質量濃度范圍內與對應的峰面積呈良好的線性關系，相關系數為0.9982～0.9999，以定量離子3倍信噪比(S/N=3)得到檢出限(LOD)，以定量離子10倍信噪比(S/N=10)得到定量下限(LOQ)，17種氨基酸的標準曲線和相關系數見表2。

表2 17種氨基酸的線性方程、檢出限和定量限

2.4 游離氨基酸和酸化后氨基酸的含量

按照1.3.1對7批次魚醬酸樣品進行處理，17種氨基酸水解總含量為0.520%～3.335%，其中胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和組氨酸含量低于0.03%，丙氨酸和亮氨酸含量高于0.15%。17種氨基酸酸水解總含量為1.807%～3.889%，其中氨酸、胱氨酸、酪氨酸和蘇氨酸含量低于0.10%，其中一批次魚醬酸調味料的水解和酸水解的17種氨基酸含量成分變化見圖2。

圖2 魚醬酸調味料中水解和酸水解的氨基酸含量

由圖2可知，酸水解后的魚醬酸中魚肉蛋白質轉變氨基酸，其中和甘氨酸、纈氨酸和脯氨酸變化最大。

2.5 魚醬酸中各類氨基酸的含量分布

同時，對7批次魚醬酸調味料中17種氨基酸進行含量分析，結果見圖3。

圖3 魚醬酸調味料中各氨基酸含量

由圖3可知，7批次魚醬酸調味料中亮氨酸的含量較高，質量分數為0.338%～1.219%，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的含量處于同一水平，質量分數為0.008%～0.690%，絲氨酸、甲硫氨酸、組氨酸含量處于同一水平，質量分數為0.004%～0.203%，胱氨酸含量最低，低于0.006%。

3 結論

本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定魚醬酸調味料中17種氨基酸含量，使用兩種不同的樣品前處理方式對魚醬酸調味料中氨基酸進行分析，確定了魚醬酸調味料中17種氨基酸的含量。本方法極大縮短了分析時間，在分析復雜樣品時可以獲得較高的選擇性和靈敏度，適用于食品中快速測定氨基酸的定性和定量分析。