定量蛋白質(zhì)組學(xué)在慢性嗜酸細(xì)胞性鼻竇炎的應(yīng)用分析

楊念念，楊枝芳，周小表，卿尚喜

（1邵陽(yáng)市中心醫(yī)院耳鼻喉科 湖南 邵陽(yáng) 422000）

（2邵陽(yáng)市中心醫(yī)院病理科 湖南 邵陽(yáng) 422000）

（3邵陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 湖南 邵陽(yáng) 422000）

慢性鼻竇炎（CRS）是一種常見病、多發(fā)病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因未明。特別是慢性嗜酸細(xì)胞性鼻竇炎（ECRS），主要由嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）浸潤(rùn)，術(shù)后炎癥難以控制，復(fù)發(fā)率高。慢性鼻竇炎分為兩種亞型，伴有或不伴有鼻息肉。該分類沒有體現(xiàn)表型（炎癥特征）和發(fā)展趨勢(shì)（是否易復(fù)發(fā)），難以實(shí)施針對(duì)性的治療。嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）在鼻黏膜組織中大量聚集，表明其在發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1]。TMT定量蛋白質(zhì)組結(jié)合液相質(zhì)譜法，選出差異蛋白，分析其作用與功能，為闡明ECRS的發(fā)病機(jī)制，尋找治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本采集自邵陽(yáng)中心醫(yī)院耳鼻喉科2018年10月—2019年7月收治的12例患者，男6例，女6例。ECRS組4例，非ECRS組4例，正常對(duì)照組4例（僅鼻中隔偏曲）。所有患者均無哮喘史或阿司匹林過敏史，術(shù)前2周未使用抗生素或激素。所有患者均簽署知情同意書。平均年齡為（46.7±1.54）歲。鼻黏膜和鼻息肉標(biāo)本在鼻內(nèi)鏡下采集固定，在病理科進(jìn)行標(biāo)本的組織學(xué)形態(tài)和Eos的顯微鏡下觀察。另一部分標(biāo)本用生理鹽水快速?zèng)_洗，去除血和骨碎片。PBS沖洗后，用錫箔紙包好，放入塑料冷藏管中，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1主要試劑和儀器 蛋白定量試劑盒、TMT試劑購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司，十二烷基磺酸鈉購(gòu)于Amresco公司，乙腈購(gòu)于J.T.Baker公司，胰酶購(gòu)于Gibco公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)別。

1.2.2提取標(biāo)本裂解和蛋白定量 樣品裂解及蛋白定量：解凍后，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入適量的裂解液，電動(dòng)研磨裝置充分勻漿。組織裂解液95 ℃孵育至完全變性。室溫離心，取上清液置于全新的微離心管中。熒光光譜法測(cè)定氨基酸序列中的色氨酸。光度計(jì)檢測(cè)色氨酸熒光強(qiáng)度。用色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中色氨酸的濃度，得到樣品中蛋白質(zhì)的濃度。采用樣品選擇、蛋白質(zhì)提取和定量步驟控制實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。蛋白質(zhì)酶解：取樣品加入超濾管中。離心后，棄濾液。加入緩沖液，離心，棄濾液。加入吲哚乙酸，室溫反應(yīng)，離心后棄濾液。加入碳酸三乙二胺緩沖液，離心后棄濾液。加入胰酶質(zhì)譜測(cè)序，37℃消化過夜。收集濾液，冷凍干燥。100 mmol/L三乙胺硼烷溶解樣品，檢測(cè)pH約8.5。TMT標(biāo)記試劑加入各組肽段中，混勻，搖床室溫4h。加入羥胺終止反應(yīng)，搖床室溫20min。等比混合，酸化樣品，脫鹽、抽干。

1.2.3 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析以及數(shù)據(jù)檢索

抽干后樣品用2%甲酸溶解；12 000 r/min離心5 min，進(jìn)行LC-MS/MS（液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用）分析。HPLC反向柱層析系統(tǒng)采用300 nl/min流速，乙腈梯度進(jìn)行樣品分離檢測(cè)，時(shí)間4 h；HPLC與LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜偶聯(lián)，從一級(jí)譜圖中選取信號(hào)最強(qiáng)的3個(gè)進(jìn)行HCD碎裂。數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer軟件分析。

1.2.4生物信息學(xué)分析

選擇表達(dá)變化大于1.3倍（蛋白比大于1.3或小于0.75）的蛋白作為差異蛋白。對(duì)這些蛋白進(jìn)行基因本體（GO）注釋分析和功能聚類分析。從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索差異蛋白，并對(duì)其功能進(jìn)行分類分析。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)處理：采用IBM SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。根據(jù)不同TMT試劑報(bào)告的離子相對(duì)豐度，得到蛋白質(zhì)的相對(duì)定量結(jié)果。同一蛋白在一組與另一組之間的比值（Ratio）認(rèn)為大于1.3倍，即大于1.3表示上調(diào)，小于0.75表示下調(diào)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 蘇木精-伊紅染色區(qū)分組織學(xué)類型

隨機(jī)選擇5個(gè)高倍顯微鏡視野（×400）進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算Eos在炎癥細(xì)胞總數(shù)中的平均百分比，達(dá)到10%為ECRS，其余為非ECRS[2]。ECRS上皮下基質(zhì)中嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，非ECRS間質(zhì)中偶見嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 ECRS組織病理學(xué)形態(tài)

2.2 組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定與初步分析

嗜酸性陽(yáng)離子蛋白、IL-33因子、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽、IL-31因子、核苷二磷酸激酶、PLUNC蛋白在ECRS組織中表達(dá)較正常對(duì)照組鼻黏膜組織呈顯著性差異。見表1所示。

表1 ECRS與非ECRS組織中部分差異表達(dá)蛋白

3.討論

嗜酸性陽(yáng)離子蛋白（ECP）主要來源于活化的Eos脫顆粒，具有多種生物活性，主要分為細(xì)胞毒性和非細(xì)胞毒性效應(yīng)，強(qiáng)大的細(xì)胞毒性效應(yīng)可引起寄生蟲殺滅、腫瘤細(xì)胞殺死、呼吸道損傷。Eos脫顆粒釋放ECP等毒性蛋白在發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要。IL-5和Eos趨化素Eotaxin等在聚集活化Eos過程中被證實(shí)必不可少。Bacher等發(fā)現(xiàn)IL-5在絕大多數(shù)鼻息肉標(biāo)本大量表達(dá)，而在對(duì)照組卻沒有，說明主要由Eos產(chǎn)生的IL-5在Eos主導(dǎo)的鼻息肉發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，且可能存在一個(gè)自分泌環(huán)。Kramer等[3]更進(jìn)一步指出IL-5在嗜酸性炎癥組織中處于樞紐地位。Reh等應(yīng)用CpG刺激難治性CRSwNP粘膜上皮細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)IL-33表達(dá)明顯上調(diào)，提示IL-33表達(dá)可能在外界刺激下發(fā)生改變。有報(bào)告發(fā)現(xiàn)在篩竇炎癥黏膜中IL-31、IL-33及其受體ST2，和對(duì)照組相比，明顯高表達(dá)[4]。本研究中，與對(duì)照組正常黏膜相比，IL-33在ECRS組和非ECR組的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。ECRS免疫學(xué)特性是引起強(qiáng)烈Th2反應(yīng)，病理特點(diǎn)是Eos滲透，猜測(cè)IL-33可能在介導(dǎo)Eos優(yōu)勢(shì)滲透中起監(jiān)管及調(diào)節(jié)作用。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（PACAP）是由抗原或炎癥刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)肽。研究表明，PACAP抑制促炎反應(yīng)因子，促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞的分化。有望用于治療急慢性炎癥、感染性休克或自身免疫性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，它們?cè)贓CRS中表達(dá)量較高，推測(cè)細(xì)菌、病毒、真菌等病原體激活了鼻粘膜炎癥防御反應(yīng)系統(tǒng)。核苷二磷酸激酶可以催化磷酸化反應(yīng)，在炎癥性疾病中的作用還有待進(jìn)一步研究。PLUNC蛋白質(zhì)是一種上呼吸道分泌蛋白，表達(dá)于上呼吸道和口腔。它屬于脂多糖結(jié)合蛋白和/或抗革蘭氏陰性菌入侵的增透蛋白，可能在上呼吸道先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。

總之，ECRS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，難點(diǎn)在于病因的研究和可能的根治性治療[5]。TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)能有效篩選ECRS組織中的差異蛋白。嗜酸性陽(yáng)離子蛋白、IL-33因子、PACAP、IL-5因子、核苷二磷酸激酶、PLUNC蛋白，與ECRS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可作為ECRS的候選標(biāo)志物。哪一種或幾種蛋白質(zhì)起作用還待進(jìn)一步研究。