基于拉曼光譜方法研究不同剪切力下的紅細胞亞損傷

王金爽， 付瑩瑩， 符珉瑞， 高 斌*， 鄭大威， 常 宇

1. 北京工業大學環境與生命學部， 北京 100124 2. 浙江大學醫學院附屬兒童醫院國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心， 浙江 杭州 310003

引 言

血液損傷狀況是評價人工心臟泵設計是否可用的一個重要指標， 血細胞在人工心臟泵葉輪轉動過程中產生的剪切應力的作用下受到損傷， 導致其耐受性降低、 壽命下降[1-3]。 當細胞受損傷達到細胞可承受的閾值后， 紅細胞破裂， 細胞內部的血紅蛋白外泄， 即發生溶血。 目前評價血液損傷仍然采用測量游離血紅蛋白的方法， 只考慮完全破裂的紅細胞。 而事實上完全破裂產生溶血的紅細胞只占一小部分， 未破裂的紅細胞被發現也受到了不同程度的不可逆損傷， 這種現象被稱作紅細胞的亞損傷[4]。 Horobin[5]、 Michael[6]研究發現紅細胞暴露在超生理的剪應力下(50 pa以上)時， 雖然未破裂但其形變能力已經受損。 因此在評價血液損傷時需要關注紅細胞亞損傷狀況， 對于紅細胞亞損傷還需要更多的研究。

目前也有一些學者從不同角度對紅細胞亞損傷情況進行了研究， 例如， 設置機械敏感性指數以確定亞溶血閾值[7]； 通過紅細胞機械脆性、 血漿游離血紅蛋白等多種參數綜合來評價血液損傷[8]。 但現有的研究存在計算困難， 方法復雜等問題。

拉曼檢測技術可實現快速、 無損、 定量的檢測， 其光譜具備指紋光譜特征能夠真實的反映物質的內部分子結構信息， 在評估細胞的結構與功能的損傷方面得到了廣泛的應用[9]。 但是能否用于評估紅細胞的亞損傷尚不清楚。 因此本文開展體外血液剪切應力實驗， 驗證拉曼光譜對紅細胞亞損傷程度的評估能力。

本研究將拉曼光譜技術應用到人工心臟泵領域可以更加細致的分析人工心臟泵磨損后的血液亞損傷狀況。 利用共聚焦拉曼儀器， 測量了0， 50， 100， 150， 200， 250和300 pa剪切應力作用下的紅細胞拉曼譜圖， 通過對比紅細胞的拉曼譜圖變化， 評估紅細胞亞損傷的程度， 為建立更加全面的人工心臟泵血液損傷評價體系提供參考。

1 實驗部分

inVia共聚焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw公司)， TG-16WS高速離心機(湖南湘儀離心機有限公司)， 血液剪切力試驗平臺(課題組搭建)； 實驗用豬血(北京實創世紀小型豬養殖基地)， Amresco 血紅蛋白標樣(北京邁瑞達科技有限公司)， HyClone 磷酸鹽緩沖溶液( PH7.4)(北京邁瑞達科技有限公司)。

血液剪切力試驗平臺[10]主要由微控注射泵、 聯通管路和剪切力模擬裝置組成。 剪切力模擬裝置內部為圓柱形轉子， 外部為同軸心的筒型圓柱定子， 試樣從轉子和定子之間0.1 mm的縫隙內流過， 通過調節轉子的轉動速度對試樣施加不同大小的剪切力。 本實驗中， 通過試驗平臺分別對測試血樣施加暴露時間(微控注射泵控制試樣流過剪切模擬裝置的時間)為1 s， 大小分別為0， 50， 100， 150， 200， 250和300 pa的剪切力。

紅細胞懸液配制： 將1.5 mL磨損后的血液樣本以1 600 r·min-1離心5 min； 去除上層清液后加入3倍以上體積的PBS， 用移液槍吹散細胞(重復以上步驟， 洗滌紅細胞3次)； 取出50 μL的下層紅細胞， 用PBS稀釋至5 mL后混勻備用。 血紅蛋白溶液(稀釋法)配制： 稱取血紅蛋白粉末后， 將血紅蛋白粉末用超純水進行溶解， 配置成100 mg·L-1濃度的血紅蛋白溶液。 血紅蛋白溶液(溶脹法)配制： 取150 μL的底層紅細胞， 加超純水稀釋至1.5 mL， 以15 000 r·min-1離心35 min， 上層清透溶液即為血紅蛋白溶液。

實驗采用100倍長焦物鏡， 532 nm激光光源波長， 積分時間為10 s， 積分次數為2次， 測量功率2.5 mW， 掃描范圍500～1 800 cm-1。 取樣本溶液10 μL滴至載玻片， 置于共聚焦拉曼顯微鏡載物臺上直接測量， 對每一樣本溶液進行不少于20次的采集。 實驗用WIRE4.0對測量后的原始譜圖進行基線校正、 平滑降噪的預處理。 Origin8.0對譜圖歸一化處理后取平均值， 根據紅細胞的拉曼譜圖對比， 評估紅細胞亞損傷的程度， 運用曲線擬合方法對剪切應力下紅細胞的特征峰進行擬合， 驗證拉曼光譜對紅細胞亞損傷程度的評估能力。

2 結果與討論

2.1 紅細胞與血紅蛋白標準譜圖及特征峰

實驗測定了相同條件下紅細胞與血紅蛋白的標準譜圖， 對比如圖1所示， 其中血紅蛋白溶液(稀釋法)要比直接測量血紅蛋白粉末測得的峰位置信息更加豐富。 測量紅細胞譜圖與血紅蛋白溶液(溶脹法)測得的游離血紅蛋白峰位置、 峰強幾乎一致， 且比血紅蛋白溶液(稀釋法)和血紅蛋白粉末的峰位置信息更加精細、 豐富、 精確度高， 表現為1 549和1 604 cm-1兩位置的特征峰。 圖1中所標注的峰位置皆為血紅蛋白特征峰， 峰的歸屬列出如表1所示。 1 549 cm-1峰位置歸屬與1 562 cm-1一致， 1 604 cm-1峰位置歸屬與1 586 cm-1一致。 對紅細胞懸液樣本在同樣的采集條件下重復采集， 經預處理后的譜圖如圖2所示， 紅細胞特征峰表現穩定。 紅細胞譜圖能夠反映血紅蛋白的內部結構， 且以本方法采集紅細胞譜圖方法正確、 重復性好。

圖1 紅細胞和血紅蛋白拉曼標準譜圖對比

圖2 紅細胞懸液拉曼譜圖重復采集結果

表1 532 nm紅細胞譜圖特征峰歸屬表[11-14]

2.2 共聚焦顯微拉曼測定不同剪切力下的紅細胞

2.2.1 不同剪切力紅細胞譜圖對比與分析

由圖3看出， 相同批次的血液樣本， 測量游離血紅蛋白吸光度為0.066， 對不同剪切力作用下紅細胞懸液樣本采集的譜圖有明顯差異。 1 280～1 680 cm-1區間放大如圖4所示， 隨著剪切力的增大， 1 376 cm-1峰位置左側明顯抬高， 1 549和1 604 cm-1峰的強度升高， 1 639 cm-1峰的強下降。 1 300～1 500 cm-1的譜帶強度主要由吡咯環呼吸振動引起， 尤其1 376 cm-1峰位置對氧化態敏感， 此處的降低標志著血紅素凝集[14]， 由左側的抬高可以看出血紅蛋白的內部結構發生了變化。 1 500～1 600 cm-1為亞鐵離子高自旋標記帶， 1 549和1 604 cm-1峰的強度升高， 亞鐵離子脫氧高自旋[11]， 血紅蛋白向去氧態發展， 難以與氧結合。 1 638 cm-1位置為氧濃度的標記帶， 表征α螺旋結構[12]， 且對卟啉環氧化作用敏感， 此處減小說明α鏈合成減弱， 血紅蛋白不易與氧結合。

圖3 不同剪切力下紅細胞拉曼譜圖對比

圖4 1 280～1 680 cm-1不同剪切力下紅細胞拉曼譜圖對比

2.2.2 不同剪切力紅細胞譜圖的統計學分析

在測量功率2.5 mW、 積分時間10 s、 積分次數2次的條件下對每一溶液樣本進行20次的測量采集， 經對比發現不同剪切力的作用下， 1 549 cm-1位置的ν11亞鐵離子高自旋振動標記帶的峰強差異最明顯。 圖5給出了不同剪切力下1 549 cm-1位置峰強的散點圖， 說明不同剪切力下亞損傷紅細胞的譜圖采集穩定性較好， 誤差較小。 剔除個別離散點后取平均， 對不同剪切應力下1 549 cm-1位置峰強進行擬合， 擬合發現線性擬合效果最好， 結果如圖6所示， 在1 549 cm-1位置， 剪切力大小與拉曼峰強之間呈現良好的線性關系。

圖5 1 549 cm-1位置不同剪切應力的散點圖

圖6 不同剪切應力與1 549 cm-1位置峰強擬合結果

2.3 重復性實驗驗證與分析

對不同批次的血液， 測量游離血紅蛋白吸光度為0.110， 進行了不同剪切力下紅細胞的拉曼譜圖采集的重復性實驗， 檢測結果如圖7所示， 隨著剪切應力的增大， 除了1 376 cm-1峰位置左側明顯抬高， 1 549和1 604 cm-1位置峰強升高， 1 638 cm-1位置峰強下降以外， 在998和1 173 cm-1位置， 峰強也有增高的趨勢。 同樣對1 549 cm-1位置的峰強進行擬合， 擬合結果如圖8所示， 說明在1 549 cm-1位置， 剪切力大小與拉曼強度之間呈現良好的線性關系。

圖7 重復實驗中不同剪切力下紅細胞拉曼譜圖對比

圖8 重復實驗中不同剪切應力與1 549 cm-1 位置峰強的線性擬合

對比兩組實驗結果， 可以看出雖然1 549 cm-1峰的強度與剪切應力之間都呈現良好的線性關系， 且誤差小區分明顯， 但兩次實驗的擬合曲線k值有所差別。 倒置顯微鏡下觀察兩組血液樣本的紅細胞形態大部分完好， 幾乎無差別， 經過分光光度法測量， 兩批血樣的游離血紅蛋白含量不同。 猜測擬合曲線的k值的不同可能是由于不同批次的血液樣本質量、 紅細胞的耐受程度不同導致的， 這部分后續將做深入探究。 所以利用拉曼光譜法不僅可以簡單的區分不同剪切力條件下的血樣， 也可以很好的評價血液樣本的質量， 尤其是在分光光度計測量溶血指標變化不大、 光鏡觀察紅細胞形態幾乎無差別的情況下， 拉曼則有可能檢測到紅細胞內部結構更細微的變化， 可以更精確的鑒定紅細胞的損傷程度。

另外， 根據對紅細胞與血紅蛋白標譜的對比結果， 紅細胞譜圖能夠反映血紅蛋白的內部結構， 不同剪切力的作用下， 紅細胞的拉曼譜圖變化體現其血紅蛋白內部結構發生了變化， 說明剪切力可以透過細胞膜對紅細胞內血紅蛋白產生影響。 在細胞膜未破裂的情況下， 剪切力的作用會導致處于1 639 cm-1位置的氧濃度標記帶減弱， 這與G. Rusciano[13]的研究結果是一致的。 1 549和1 604 cm-1處的吸收峰峰強升高， 亞鐵離子脫氧高自旋， 導致血紅素與吡咯環之間的距離減小， 紅細胞直徑減小[4]。 考慮可能存在胞漿的流出導致血紅蛋白濃度相對增加[4, 15]， 細胞內粘度增加， 使得細胞直徑的減小， 從而影響到血紅蛋白的內部結構。 但具體剪切應力是如何透過細胞膜而影響到其內部血紅蛋白結構的機制還有待探討。

3 結 論

實驗測定不同剪切力下紅細胞的拉曼譜圖， 結果顯示1 376 cm-1峰位置左側譜線明顯抬高， 1 549和1 604 cm-1位置峰強隨著剪切力的增大升高， 1 639 cm-1位置峰強則減弱。 其中1 549 cm-1位置峰強為亞鐵離子高自旋帶， 與β鏈螺旋結構有關， 在不同剪切力的作用下， 峰強差異表現最明顯。 經曲線擬合， 發現此位置紅細胞的峰強與剪切應力呈明顯的正向線性關系， 線性擬合效果良好。 經過重復性實驗驗證， 證明該方法且具有較好的重現性。 另外根據不同剪切力作用導致紅細胞拉曼譜圖的變化， 而紅細胞譜圖能夠反映血紅蛋白的內部結構， 說明剪切應力可以透過細胞膜而影響到其內部血紅蛋白結構。 利用拉曼技術可以準確、 快速的區分在不同剪切應力下受到不同程度損傷的紅細胞， 并能根據譜圖推論分析細胞內部結構的變化， 樣本處理簡單、 耗時短、 操作簡便。 未來可以嘗試定量分析， 建立更加全面的紅細胞損傷評價體系， 進一步拓寬拉曼檢測方法在人工心臟泵血液損傷評價方面的應用。