真菌鑒別和檢測的SERS光譜技術研究進展

李 玲， 何薪宇， 李世芳， 葛 闖， 徐 溢,4*

1. 重慶大學新型微納米器件與系統技術重點學科實驗室&光電技術與系統教育部重點實驗室， 重慶 400044 2. 重慶大學化學化工學院， 重慶 400030 3. 重慶大學腫瘤醫院， 癌癥轉移和個體化治療轉化研究重點實驗室， 重慶 400030 4. 重慶大學光電工程學院， 重慶 400044

引 言

真菌(fungus; eumycetes)是具有細胞核和細胞壁的異養生物， 是生物界中很大的類群， 通常分為酵母菌、 霉菌和蕈菌(大型真菌)三大類， 世界上已被描述的真菌屬達1萬以上， 種超過10萬個。 在多數真菌的細胞壁中最具特征性的是甲殼質(chitin)， 其次是纖維素。 常見的真菌細胞器有： 線粒體， 微體， 核糖體， 液泡， 溶酶體， 泡囊， 內質網， 微管， 鞭毛等， 常見的內含物還有肝糖， 晶體， 脂體等。 近年來， 隨著廣譜抗生素、 糖皮質激素、 免疫抑制劑的廣泛使用， 以及各種介入性醫療技術的使用， 臨床上真菌感染的數量及種類逐年增加， 已成為醫院內感染的主要原因之一。 例如， 臨床分析發現絕大多數醫院臨床真菌感染的源頭是念珠菌， 其中白色念珠菌占全部感染的60%左右， 導致死亡率接近40%[1]， 這種感染甚至能引起器官移植患者、 癌癥患者和艾滋病患者的死亡。 因此， 高效辨識和監測真菌的方法和技術備受關注。

傳統的真菌檢測方法是培養與鏡檢， 培養是真菌學檢查的“金標準”， 但其具有耗時長、 易污染、 靈敏度低、 無法區分定植菌及感染菌等缺點[2]； 直接鏡檢更簡便、 快速， 但其準確率普遍不高， 難以為真菌早期診斷提供準確判斷。 近年來， 分子生物學檢測法是目前國內外研究發展熱點， 具有特異性強、 靈敏度高的特點[3]， 具體包括： 聚合酶鏈式反應法、 G試驗法和GM試驗法(galactomannan, GM test)等, 但這類方法成本較高， 操作復雜且未標準化， 臨床上易產生假陽性結果。 隨著現代儀器科學與技術的發展， 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)[4]和環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAM)等技術開始應用于真菌鑒定和檢測， 但其對于檢驗人員要求較高， 涉及的實驗儀器也比較昂貴， 在臨床快速診斷中的應用受到限制。 因此， 研發并建立真菌快速、 高效的檢測方法、 技術和系統具有重要的研究意義和迫切的應用需求。 基于前期研究和調研， 我們發現拉曼(Raman)光譜尤其是表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)光譜分析技術在真菌鑒別和檢測領域大有可為。

據此， 本文以臨床診斷和環境空間中真菌為檢測對象， 重點對Raman/SERS在真菌鑒別和檢測中的應用進行探討， 尤其針對納米SERS增強介質材料、 SERS標簽(SERS tag)信號放大效應以及集成SERS的微流控芯片分析方法等研究新進展進行綜述， 分析探討Raman /SERS應用于真菌檢測的優勢及其發展趨勢。

1 Raman/SERS光譜分析及其真菌檢測可行性分析

Raman光譜分析技術因其具有能提供分子基團結構信息、 無需對樣品進行前處理、 無水分干擾、 易于實現原位實時檢測等優點， 特別適用于生物樣本及生化體系的檢測。 早在1995年， Edwards等[5]報道了利用拉曼光譜技術對三種不同屬的真菌樣本進行檢測， 并對拉曼譜峰進行了歸屬指認。 10年后， Gussem等[6]確認收集到的拉曼信號主要來源于真菌細胞壁上的多糖、 幾丁質和支鏈淀粉以及細胞膜上的脂質和磷脂。 但是， 由于Raman光譜是基于散射光信號建立的光譜分析技術， 散射信號強度弱且重現性較差， 大大限制了其在復雜生命體中的應用。

隨著材料學、 光學、 儀器科學等相關領域的迅猛發展， 通過引入納米技術而建立的SERS光譜分析技術， 利用粗糙的金屬表面等離子體， 在納米級間隙(通常是1 nm)的區域內產生熱點， 極大地增強待測物分子的Raman信號， 可實現目標物的更高效檢測。 基于SERS光譜分析理論研究的不斷深入， 人們發現其除具備Raman光譜分析所具有的基本特性外， 更在檢測靈敏度、 抗光漂白、 易于實現原位無損檢測等方面顯示出強大優勢。 據此， SERS光譜分析技術被廣泛用于多種生化樣本的檢測， 如： 磷脂、 葡萄糖、 谷胱甘肽、 凝血酶等[7]， 近年來更是被拓展到了細菌和細胞等生命體中[8]， 也使得真菌的高效SERS檢測和臨床診斷成為可能。 本課題組前期已開展了將SERS光譜技術應用于生物分子、 細菌和細胞及其相關生化過程研究[9-11]。 Gussem[6]等應用Raman光譜分析乳桿菌(Lactarius)的真菌孢子， 解析其組成成分， 將得到的真菌光譜與已知存在于大型真菌中的參考物質的拉曼光譜進行比較， 包括糖類， 脂質和一些可用作特異性生物標記物(腺嘌呤， 麥角甾醇和甘氨酸)的次要化合物。

與傳統生化小分子Raman/SERS檢測大量的文獻報道相比， 以真菌為樣本的SERS檢測研究報道相對較少。 這是由于對于真菌這種真核細胞生命體， 其成分復雜且本身具有一定的不均一性， 檢測特性與細菌和細胞的檢測有一定的相似性， 面臨檢測靈敏度低、 信號復雜、 選擇性和特異性差以及信號重現性和穩定性不佳等難題。 盡管如此， 當針對真菌SERS檢測中的這些難點有所突破時， 就有理由相信SERS對真菌的檢測和相關研究是可行的， 并具有極大地發展潛力。

2 基于多種納米微結構SERS基底的真菌鑒別

SERS的增強模式主要有電磁場增強以及化學增強[12]， 其是依托金屬、 半導體及多種復合納米微結構來實現的。 這些活性納米基底的結構和效能對于提高SERS檢測靈敏度、 重復性尤為重要。 最常應用于SERS檢測的是金納米粒子(Au NPs)和銀納米粒子(Ag NPs)， 通過更改金屬納米粒子的形貌， 制備成納米棒[13]、 納米簇[14]、 納米星[15]等， 可形成熱點效應， 顯著增強待測物Raman信號。 采用單一金屬納米材料其增強效能往往也不能達到測試的需求， 于是， 過渡金屬、 TiO2、 CuO、 ZnO等半導體材料以及復合納米材料進入人們視線[16]， 目前， 多種復合納米結構更是顯示出優異的SERS效能， 如殼核納米顆粒結構、 二維Au納米傘結構、 多面體Ag顆粒和原子層沉積納米顆粒等， 更有金屬納米顆粒與磁性半導體材料、 有機聚合物等多種納米材料復合[17]， 這些新型的納米微結構具有更好的生物兼容性、 更強的吸附能力和更強的增強效果， 可實現更高效的SERS檢測[18]。 近年來， 隨著納米材料及其制備技術的迅猛發展， 結構有序可控的SERS基底納米微結構設計與制備日趨成熟， 許多合成制備技術， 微機電系統(MEMS, Micro-Electro-Mechanical System)加工工藝等能夠用于制備具有良好重復性能的SERS基底[19]， 如化學還原法、 磁控濺射、 電子束光刻技術和自組裝等。

基于多種類型的納米微結構SERS基底的發展和應用， 近年來人們開始將SERS光譜技術應用于病毒、 真菌、 細菌和細胞及其相關生化過程的監測和研究。 Sivanesan等[20]在粗糙化的納米銀基板上通過恒電位電沉積薄金層， 獲得銀-金雙金屬復合SERS基底， 涂覆抗生素后， 從血液樣本中選擇性鑒定出大腸桿菌、 腸炎鏈球菌和表皮葡萄球菌。 Luo等[21]通過疏水相互作用將油溶性Ag NPs與多孔碳膜自組裝獲得SERS基底， 結合主成分分析(principal component analysis, PCA)， 有效區分了豬圓環病毒2型(PCV2)、 豬細小病毒(PPV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)。 Witkowska等[22]以納米Ag作為SERS增強基底， 測得這三種不同屬真菌： 毛癬菌， 小孢子菌和表皮癬菌的SERS光譜， 利用主成分分析， 實現了對常見皮膚真菌毛癬菌不同亞種的有效鑒別， 使同屬不同亞種真菌的鑒別成為可能。 Dina等[23]采用化學還原法合成Ag NPs， 輔以主成分分析法及線性判別法(principal component analysis-linear discriminant analysis, PCA-LDA)， 成功用SERS技術對煙曲霉、 隱孢曲霉和粉狀根霉三種真菌進行了鑒別(圖1)， 整個過程耗時僅5分鐘， 大大縮短了侵襲性真菌感染的確診時間。 Prusinkiewicz等[24]通過Au NPs與構巢曲霉共孵育后， 采用SERS光譜對真菌細胞內外進行檢測， 利用獲取的SERS圖譜還開展了真菌細胞環境分析。 Tripathi等[25]通過拉曼光譜對水懸浮液中不同濃度的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌孢子的混合物進行研究和區分。 王科兵等[26]基于納米銀膠建立了SERS法快速判別失活白色念珠菌的方法， 白色念珠菌滅活后的SERS光譜與失活前的光譜有明顯差異。

圖1 煙曲霉、 隱孢曲霉和粉狀根霉三種真菌的SERS光譜及主成分分析中PC1和PC2得分[23]

可以看到， 融合納米技術的SERS光譜檢測技術在真菌類菌種的鑒別以及臨床疾病的快速診斷方面顯示出非常好的發展潛力和應用前景。 但目前SERS在真菌檢測中的研究和應用相對較少， 其面臨檢測靈敏度不高、 信號穩定性不佳、 信號識別有難度等局限和不足。 研發更為高效的納米SERS基底和納米微結構， 改進檢測模式， 可以使SERS在真菌檢測中發揮更大的優勢。

3 基于SERS tag信號放大機制的真菌高效定量檢測

將SERS技術應用于真菌檢測時， 面臨的核心問題就是靈敏度、 重現性和特異性。 真菌樣本自身的特性， 制約了SERS光譜對其進行高效定量測試。 為了解決這個問題， 人們提出采用SERS標簽(SERS tag)的檢測策略和方法。 SERS tag的設計思想主要包括： SERS活性金屬納米粒子制備， SERS報告分子連接， 表面修飾， 探針分子(抗體、 適配體等)結合， 由此實現目標組分的信號放大和高效檢測(圖2)[27]。 SERS tag由金屬納米基底材料與能夠提供特征性SERS指紋圖譜的信號分子組成， 目前常用的信號分子包括： 4-巰基苯甲酸(MBA)、 苯-4,4’-二硫醇(DBDT)、 內消旋-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、 Ru(bpy)(三(2,2’-聯吡啶基)氯化釕(Ⅱ))、 羅丹明6G(R6G)、 孔雀石綠異硫氰酸酯(MGITC)等[28]。 近年來， 多種新型SERS tag被設計和制備出來， 成功應用于生物分子、 病原菌、 細胞等的特異性檢測， 甚至被用于體內組織或者器官的活體成像， 其在提高SERS檢測靈敏度的同時， 更是對特定樣本實現了高選擇性甚至是特異性檢測。

圖2 SERS tag用于生化檢測的設計思路[27]

Zhao等[29]制備了一種由AgNPs和5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)報告分子組成的SERS tag， 與磁性納米顆粒通過抗體抗原反應進行偶聯后， 用于未經處理的全血樣本中基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的免疫檢測， 檢測限為1 pg·mL-1[圖3(A)]。 Bamrungsap等[30]采用層層組裝的方法在金銀納米棒(Au-Ag NRs)表面組裝了拉曼報告分子4-氨基硫酚和熒光標記的適配子， 以此合成雙功能SERS tag， 可實現宮頸癌細胞上表達的人蛋白酪氨酸激酶-7(PTK-7)的特異性靶向與熒光成像。 Madiyar等[31]利用氧化鐵-金(IO-Au)核殼納米卵形顆粒(NOV)包被QSY21拉曼報告分子制成SERS tag， 并通過特異性免疫化學連接到大腸桿菌菌株DHα5上， SERS tag的拉曼信號增強效果與介電泳富集效果相結合， 捕獲時間僅為50 s， 檢測下限可達210 cfu·mL-1[圖3(B)]。

圖3 不同SERS tag的生化檢測策略示例[29, 31]

Mabbott等[32]以單鏈硫代DNA修飾的銀羥胺納米粒子作為SERS tag， 結合主成分分析法， 成功對白色念珠菌、 光滑念珠菌、 克魯斯念珠菌和煙曲霉進行鑒別和歸類(圖4)。 Yuan等[33]利用抗菌肽(AMP)功能化磁性納米顆粒作為細菌分離探針， 4-巰基苯基硼酸(4-MPBA)修飾的鍍金銀氧化石墨烯(Au@Ag-GO)納米復合材料作為SERS tag， 分離并檢測了大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌， 每種細菌的最低檢測濃度僅為10 cfu·mL-1。 Zhang等[34]利用萬古霉素修飾Fe3O4@Au磁性納米顆粒， 開展細菌的廣譜識別和高效富集， 使用適配體功能化的SERS tag， 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的檢測限分別達到20和50 cells·mL-1。 Pang等[35]采用適配體-Fe3O4@Au磁性納米顆粒作為磁性底物和SERS激活底物， 基于金殼的雙SERS增強和適配體/萬古霉素的雙重識別能力， 用于目標細菌的富集和定量檢測， 可以在沒有其他非靶標細菌干擾的情況下， 在50 min內對金黃色葡萄球菌的檢測達到3 cells·mL-1的檢測限。 這些研究顯示， SERS tag所帶來的高特異性和高靈敏度在臨床應用方面極具前景。

圖4 肉眼難以分辨的不同SERS tag與不同真菌結合后的SERS光譜(a)及利用PCA對不同的SERS譜圖進行識別(b)[32]

為了進一步提高SERS tag在檢測中的穩定性， 人們發展并研制出核-殼納米粒子結構的SERS tag。 He等[36]將拉曼信號分子3，3’-二乙基噻三碳菁碘(DTTC)嵌入共軛金銀納米殼， 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測靈敏度可降至300 cfu·mL-1。 Ye等[37]采用種子介導法和分步納米加工法， 制備了雙金屬雙殼體(Au@BDT@Au@BDT@Ag)， 極大提高了納米粒子的SERS性能， 并建立了新的表面增強拉曼散射的側向流動免疫分析方法， 對人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotrophin, hCG)的檢測限低至0.7 mIU·mL-1(0.077 ng·mL-1)。

另外， SERS tag在拉曼成像方面也顯示出獨特的優勢。 Aberasturi等[38]設計并制備了不同的十二胺改性的聚異丁烯-α-馬來酸酐(PMA)包覆金納米星的SERS tag， 分別以不同的小分子芳香族硫醇作為報告分子， 來自五個不同細胞系的單個乳腺癌細胞可以在共同培養中被檢測、 區分和成像， 且細胞培養的SERS信號和圖像在24 h以上保持穩定。 Bohndiek等[39]設計制備了4種修飾了不同報告分子的SERS tag， 經裸鼠皮下注射后， 利用開發的小動物拉曼成像(small animal Raman imaging, SARI)儀， 可實現在較大區域(>6 cm2)上以高空間分辨率的快速成像， 如圖5所示， 觀測到SERS tag在裸鼠肝臟的蓄積， 實現了活體內的器官成像。

圖5 活體SERS成像： 注射四種SERS tag (S420， S421， S440， S470)后小鼠肝臟的SERS成像圖[39]

1 hour after injection (left) and 2 hours after injection (right)

可以看到， 基于SERS tag設計與制備技術的快速發展， 新型SERS tag在滿足特異性檢測目標分析物的同時， 可進一步提高了檢測的靈敏度與重現性。 SERS tag在細胞和細菌檢測中顯示出成效， 也有少量針對真菌的研究， 而將SERS tag用于真菌的高效定量檢測必將受到關注和發展。

4 基于集成SERS的微流控芯片真菌高效檢測

微流控芯片分析技術不僅可將樣品預處理、 分離、 檢測等多個基本操作單元集成， 而且可與多種檢測技術進行結合， 實現生化樣本的高通量及高內涵檢測， 在細菌、 真菌和細胞等研究中展現出突出的優勢和潛力。 在微流控芯片上集成SERS分析模塊， 可將含真菌的生化樣本引入到微流控芯片的設定集成納米微結構SERS檢測微區， 直接進行原位檢測并獲取其生化信息， 為生化體系的高效檢測提供了新機遇和新途徑。

眾所周知， 細菌、 真菌和細胞類生化樣本在檢測中通常存在基底復雜、 背景信號高、 水分干擾極大、 樣本暴露于空氣而受到環境中各種因素的影響等難題， 而集成SERS 基底的微流控芯片系統及相應的測試方法， 對上述難題的有效解決顯示出明顯的優勢[40]。 首先， 由于拉曼激光斑點小， 能夠在微流控芯片的通道上直接聚焦測試； 微流控芯片通道內反應試劑較少， 符合拉曼靈敏度高的條件； 由于反應試劑沒有直接接觸， 對反應體系不造成干擾； 同時， 由于SERS光譜具有特征指紋性， 能夠對反應體系中的混合物進行分析和識別。 因此， 集成SERS增強基底的微流控芯片(簡稱： 微流控SERS芯片)可提供一個生化樣本高效測試環境空間， 有效提高檢測的靈敏度、 重復性和可靠性； 同時， 將納米技術與微流控技術融合， 將推動微流控芯片的功能拓展， 在臨床診斷、 生物學等領域具有廣闊的應用前景。

Li等[41]研制的適體-表面增強拉曼散射(Aptamer-SERS)傳感芯片， 可以預先完成芯片功能化、 SERS標簽制備、 適體互補DNA雜交等復雜操作， 成功實現了真菌毒素—黃曲霉毒素B1(AFB1)的檢測， 線性范圍為1 fg·mL-1～1 ng·mL-1， 檢出限可達0.4 fg·mL-1[圖6(a)]。 Wang[42]等設計的CD式樣微流控芯片， 通過使用具有徑向微流體通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物板將寡核苷酸探針線陣列“印刷”在玻璃芯片上， 通過在螺旋通道內進行樣品雜交， 實現對濃度低至3 ng·mL-1的真菌PCR產物的檢測。 楊寧等[43]根據微尺度下孢子富集動力學特征設計了病害孢子高效富集微流控芯片， 結合光電檢測系統， 進行了水稻的稻曲病菌孢子的檢測。 Wang等[44]通過在微流控SERS芯片[圖6(b)]上同時部署針對同一病原菌不同表位的3個不同SERS探針， 實現了單細胞水平上對病原菌的不同亞種特異性檢測。 Yang等[45]研制的便攜式帶正電荷的SERS芯片， 成功用于直接從培養基中捕獲并鑒定大腸桿菌CFT 073、 銅綠假單胞菌PAO1和奇異變形桿菌PRM1等三種泌尿系統病原菌。 本課題組Su等[11]設計了集成血液分離、 試劑混合、 SERS檢測一體化的微流控芯片， 在檢測區原位集成Ag膜-納米金SERS基底[圖6(c)]， 針對水中肌酐的檢出限低至4.42×10-3μmol·mL-1， 且可在2 min內完成血液樣本中肌酐的測試。 Wang等[46]采用自組裝-化學鍍復合方法， 在微通道內的TiO2納米管的孔口表面和內壁上覆蓋Au@Ag納米顆粒作為SERS基底， 對R6G的檢測限低至10-10mol·L-1， 利用Au@Ag/TiO2納米管的光催化性能， 制備了一種新型可回收微流控SERS芯片， 可用作多種生化分子的高效SERS檢測器。

圖6 基于不同微流控SERS芯片的SERS檢測示例及得到的SERS光譜圖[41, 44, 11]

顯然， 將多種納米結構在微流控芯片上集成制備是可行的， SERS光譜采集對試劑和樣本是非接觸式的， 對生化體系和過程不會造成干擾， 拉曼激光斑點小能夠在微流控芯片的通道上直接聚焦， 同時SERS光譜具有的指紋性能夠獲得更多的生化信息。 據此， 我們認為結合微流控技術， 有望解決并突破目前SERS分析技術存在檢測效率低、 信號穩定性差、 應用范圍窄等瓶頸問題， 對真菌檢測提供更高精度、 更可靠測試手段。

5 結論與展望

針對近年來真菌感染帶來的對真菌高效檢測的需求， SERS光譜分析以其信息量豐富、 無標、 無損、 原位檢測的優勢， 在真菌的高效檢測與鑒別方面展示出良好的研究意義和應用潛力。 真菌作為一種復雜的生命體， 在其SERS檢測中涉及到許多物質、 能量以及信號的轉換， 其Raman/SERS效應也相對復雜， 在該領域仍然存在一些問題和挑戰。 提高檢測靈敏度、 重現性和選擇性是實現有效鑒別和測試的關鍵， 通過設計與制備結構可控、 增強效果佳的SERS活性增強基底， 研制特異性識別真菌的SERS tag， 在提高檢測靈敏度和選擇性的同時， 借助微流控芯片自身優勢， 改善SERS檢測的環境， 提升檢測的重現性和穩定性， 有望實現對復雜樣本中真菌的快速鑒別與檢測。