低齡兒童齲病相關(guān)的唾液生化指標(biāo)研究

張穎 賈松菠 李帆 李?yuàn)檴?張利娟 譚凱璇 盧潔 楊芳

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島266003；2.青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島266071；3.天津市兒童醫(yī)院口腔科，天津300074

低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）是指小于71 個(gè)月的兒童，任何一顆乳牙上出現(xiàn)1 個(gè)或1 個(gè)以上的齲（無(wú)論是否成為齲洞）、失（因齲所失）、補(bǔ)牙面[1]。ECC 發(fā)病率高，根據(jù)我國(guó)第四次全國(guó)口腔衛(wèi)生流行病學(xué)調(diào)查[2]，5 歲兒童齲病患病率為71.9%，其進(jìn)展迅速且累及廣泛。乳牙齲損嚴(yán)重時(shí)造成咀嚼功能降低，影響兒童的營(yíng)養(yǎng)攝入，并對(duì)頜面部以及全身的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響[3]。乳前牙的齲齒不僅影響美觀、兒童的正確發(fā)音，還給兒童心理造成一定的影響[4]。

唾液可以通過(guò)清除食物殘?jiān)锰妓釟浜土姿猁}緩沖液中和酸，維持牙齒礦物質(zhì)的過(guò)飽和以降低釉質(zhì)溶解速度以及參與獲得性生物膜的形成保護(hù)牙齒[5]；但其溫度、濕度、酸堿度以及口內(nèi)特殊的解剖結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)等也能為致齲微生物群的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造有利的環(huán)境[6]。

傳統(tǒng)的齲病診斷方法包括視診、探診結(jié)合照射咬合翼片，而射線照相術(shù)、透照、電阻抗技術(shù)設(shè)備以及基于熒光的方法可以輔助齲齒檢測(cè)[7]。此外，現(xiàn)已建立了多個(gè)齲齒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，包括基于視診標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分的國(guó)際齲齒檢測(cè)評(píng)估系統(tǒng)-Ⅱ，基于激光的激光熒光齲齒診斷系統(tǒng)和基于光熱輻射測(cè)量和調(diào)制發(fā)光的Canary齲齒檢測(cè)系統(tǒng)[8]。可是，這些檢測(cè)和評(píng)估方法操作繁瑣，都需要患兒一定程度的椅旁配合，使齲病的診斷工作耗時(shí)費(fèi)力。而本研究建立的齲病診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，基于唾液生化指標(biāo)的檢測(cè)，無(wú)需兒童的椅旁配合，操作簡(jiǎn)單易行；唾液樣本的收集過(guò)程簡(jiǎn)便無(wú)損害，可以定期監(jiān)測(cè)和評(píng)估齲病風(fēng)險(xiǎn)，能更方便、有效地區(qū)分齲病；通過(guò)檢測(cè)口腔唾液微環(huán)境，可能更接近齲病發(fā)生進(jìn)展過(guò)程的探討，為ECC 的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采集對(duì)象的選擇

2018 年8—11 月對(duì)青島市5 所幼兒園兒童進(jìn)行口腔檢查，納入標(biāo)準(zhǔn)：4~6歲兒童，其父母或其他監(jiān)護(hù)人能提供知情同意，并且能夠配合取樣。排除標(biāo)準(zhǔn)：全身性或先天性疾病、發(fā)育畸形以及身體其他部位存在細(xì)菌或嚴(yán)重感染的兒童，在3個(gè)月內(nèi)使用抗生素、氟化物和微生態(tài)調(diào)節(jié)劑以及口腔活動(dòng)矯治器的兒童。

參考以往相關(guān)研究[9-10]，最終篩選出性別和年齡匹配的120 名4~6 歲兒童，分為低齡兒童齲病組[C 組：齲失補(bǔ)牙（the number of decayed, miss‐ing and filled teeth，dmft）指數(shù)>3]和健康兒童組（H 組：dmft 指數(shù)=0），每組各60 名 （其中男女人數(shù)的比例為1∶1）。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程的細(xì)節(jié)和隨后的數(shù)據(jù)發(fā)表均經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得兒童監(jiān)護(hù)人同意。

1.2 樣本采集方法

口腔檢查：由3名兒童口腔專(zhuān)科醫(yī)生按照世界衛(wèi)生組織推薦的《口腔健康調(diào)查基本辦法》進(jìn)行檢查[11]，用dmft指數(shù)評(píng)估乳牙患齲狀態(tài)。檢查前經(jīng)過(guò)培訓(xùn)，并且檢查者間標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)結(jié)果良好（Kappa值>0.80）。檢查器械經(jīng)過(guò)嚴(yán)格高溫高壓消毒滅菌，檢查者使用探針和口鏡在自然光下檢查乳牙患齲情況。

唾液收集：唾液樣本的收集在同一時(shí)間段（上午9∶00—10∶00）。兒童取樣的當(dāng)天早晨不刷牙，收集前至少90 min 未飲水或進(jìn)食。采樣時(shí)，兒童雙手掌放在大腿上，頭部稍微向下，略微向前彎曲，囑其持續(xù)5 min 把自然、未受刺激的唾液緩慢吐入50 mL無(wú)菌離心管中，進(jìn)行編號(hào)并轉(zhuǎn)移至4 ℃保存箱直到收集結(jié)束，放置-80 ℃冰箱保存。

1.3 唾液樣本分析

唾液樣本自然解凍后在室溫下以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，選取上清液，取2 mL唾液樣本進(jìn)行檢測(cè)。

用電子pH計(jì)直接測(cè)定唾液pH值，首先用pH7緩沖液進(jìn)行校準(zhǔn)，檢測(cè)下一個(gè)樣品前將電極浸入蒸餾水，電極浸潤(rùn)部分用濾紙擦拭干凈，并用pH7緩沖液校正再進(jìn)行檢測(cè)。

利用酶標(biāo)儀測(cè)定唾液總蛋白濃度，在595 nm處測(cè)定樣本的吸光度以得出唾液總蛋白濃度。

對(duì)于唾液離子濃度的測(cè)定，根據(jù)離子色譜儀的操作過(guò)程[12]測(cè)得峰面積和峰高度，首先配制淋洗液，然后檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別計(jì)算得出 Na+、K+、Cl?、PO43?、Ca2+、NO3?、NO2?、SO42?、F?、Br?、NH4+、Mg2+的濃度。

以上的所有檢測(cè)均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析采用R 軟件包（Version 3.6.1）進(jìn)行。兩組間的生化指標(biāo)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)，采用Wilcoxon rank sum 檢驗(yàn)比較兩組數(shù)值的差異，Person 相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)生化指標(biāo)與dmft 指數(shù)的相關(guān)性，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)低齡兒童齲患者和口腔健康兒童唾液生化參數(shù)的差異，利用隨機(jī)森林（random forest，RF）算法基于全部唾液生化指標(biāo)以及篩選出的5個(gè)具有顯著差異的潛在生化標(biāo)記物，分別建立齲病診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。根據(jù)軟件包中的“rfcv”函數(shù)確定變量的特征重要性；將數(shù)據(jù)集隨機(jī)分為訓(xùn)練集（90%）和測(cè)試集（10%），對(duì)RF 模型進(jìn)行訓(xùn)練，采用10 倍交叉驗(yàn)證方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，通過(guò)受試者工作特征曲線下面積（area under the receiver operating characteristic curve，AUC） 描述和量化模型的分類(lèi)能力。

2 結(jié)果

2.1 2組唾液pH、總蛋白、離子濃度的比較

C 組和H 組間唾液生化參數(shù)的比較分析見(jiàn)表1。由表1 可見(jiàn)，C 組唾液樣本的NO3?濃度顯著低于 H 組，Cl?、Br?、NH4+、Mg2+濃度顯著高于 H 組（P<0.05）；而其余生化指標(biāo)，較之H 組，如總蛋白、K+、PO43?、Na+、F?、SO42?、Ca2+濃度，在 C組增高，pH、NO2?濃度在C 組降低，但兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 唾液生化參數(shù)與dmft指數(shù)的相關(guān)性

隨著dmft 指數(shù)的增加，NO3?的濃度顯著降低（r=?0.28，P<0.05；圖1A），Br?、Cl?、NH4+的濃度明顯增加 （r=0.39、0.39、0.33，P<0.05；圖1B、C、D）。

表 1 2組唾液生化指標(biāo)的比較Tab 1 Comparison of salivary biochemical indices be‐tween 2 groups

圖 1 口腔唾液生化參數(shù)與dmft指數(shù)的關(guān)聯(lián)性Fig 1 Correlation between salivary biochemical indices and dmft index

2.3 基于唾液生化參數(shù)建立ECC的診斷模型

不同變量的重要性略有差別，在全部變量中，Cl?、NO3?、Br?、Na+、NH4+是對(duì)模型的建立具有較高貢獻(xiàn)的變量（圖2）；而將篩選出的5 個(gè)潛在齲病標(biāo)記物對(duì)模型的重要性按照降序排列為：Cl?、NO3?、NH4+、Br?、Mg2+（圖3）。基于全部唾液生化參數(shù)信息建立的齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型（AUC=86.78%，圖4）與5 個(gè)篩選變量建立的模型區(qū)分ECC 和健康的性能基本相同（AUC=86.75%、圖5），都要高于85%，提示生化指標(biāo)在鑒別低齡兒童齲的準(zhǔn)確性和有效性方面具有較好的分辨率。

3 討論

唾液作為體內(nèi)一種獨(dú)特的體液，包含至少99%的水，其余主要為電解質(zhì)和蛋白成分。雖然電解質(zhì)和蛋白只占唾液的一小部分，但對(duì)維持口腔健康和牙體完整具有重要作用。唾液的無(wú)機(jī)成分主要來(lái)自血液，它們的含量不是恒定的，常常以離子的形式存在。唾液中這些電解質(zhì)的電解生物利用度在齲病中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)碳酸氫鹽、磷酸鹽、尿素、兩性蛋白和酶實(shí)現(xiàn)緩沖和清除食物殘?jiān)淖饔肹13]。Na+和K+等陽(yáng)離子參與跨細(xì)胞膜的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，而陰離子Cl?可以激活α-淀粉酶，F(xiàn)?具有抗齲作用[14]。

首先，本研究的效力為80%，在95%置信區(qū)間和5%的誤差范圍內(nèi)，至少需要100名參與者[15]，所以最終選取了性別和年齡匹配的120 名4~6 歲兒童進(jìn)行樣本采集。通過(guò)比較ECC 患者和健康兒童唾液生化指標(biāo)的差異，發(fā)現(xiàn)C 組的唾液NO3?濃度顯著低于H 組，并且與dmft 指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，其他研究[16-17]也得出了類(lèi)似結(jié)果。飲食中攝入的硝酸鹽通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸被集中到唾液腺，其濃度是血漿的10 倍[18]，硝酸鹽還原菌在厭氧環(huán)境下通過(guò)呼吸作用將NO3?還原為NO2?[19]，在齲病進(jìn)展過(guò)程中，隨著厭氧菌和兼性厭氧數(shù)量的增加，更多的NO3?轉(zhuǎn)化為NO2?，所以與健康兒童相比，ECC患者唾液中的NO3?濃度顯著減少。然而，C 組兒童唾液中的NO2?濃度并沒(méi)有顯著增加，這是由于亞硝酸鹽不穩(wěn)定，常作為中間產(chǎn)物，在酸的存在下易被分解為一氧化氮[20]。此外與H 組相比，C 組的pH 值略有降低，而差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；有研究[10]表明，患齲兒童唾液pH 值顯著降低，當(dāng)碳水化合物作用時(shí)，產(chǎn)酸細(xì)菌通過(guò)糖酵解作用降低酸堿度，導(dǎo)致齲齒表面脫礦[21]。這可能是由于選取的兒童飲食習(xí)慣以及取唾液樣本時(shí)間的差異造成的，而齲病是一種多因素疾病，微生物、飲食和食物都可能影響唾液的緩沖能力導(dǎo)致pH值改變。

圖 2 基于全部生化參數(shù)建立的模型變量的重要性分布Fig 2 Importance of variables in the model based on all biochemical parameters

圖 3 基于5個(gè)篩選參數(shù)建立的模型變量的重要性分布Fig 3 Importance of five variables in the model based on selected parameters

其次，C 組 Cl?、Br?、NH4+、Mg2+濃度顯著高于H組，其中Cl?、Br?、NH4+濃度與dmft指數(shù)正相關(guān)。保持牙齒的完整性是唾液的功能之一，牙齒暴露在唾液環(huán)境中，其表面形成的唾液蛋白膜起到屏障作用，減少牙齒表面的脫礦[22]。釉質(zhì)主要由無(wú)機(jī)物組成，包括羥磷灰石晶體，少量氟磷灰石以及鈉、鉀、鎂、氯等元素。一旦齲病發(fā)生，隨著口腔內(nèi)H+水平的升高，牙齒礦物質(zhì)脫礦溶解，溶解的 Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cl?和 PO43?從牙齒結(jié)構(gòu)擴(kuò)散到牙齒周?chē)耐僖褐衃23]。因此，與健康兒童相比，ECC 患者唾液中上述離子增高，其中Cl?、Mg2+具有顯著差異。離子濃度越高，說(shuō)明牙齒中礦物成分的溶解程度越高。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩組的總蛋白含量無(wú)顯著差異，在C組中略有增高，與既往研究[24]的結(jié)果相似，然而也有研究[10]發(fā)現(xiàn)，患齲兒童唾液中總蛋白含量顯著高于健康兒童。總蛋白含量在患齲兒童唾液中增加，可能是因?yàn)橐志鞍壮煞秩缛芫浮⑷殍F蛋白、唾液過(guò)氧化物酶等抗氧化劑的增加，但唾液中又有一些蛋白如黏附素和凝集素，是通過(guò)增加微生物的定植發(fā)揮有害作用的[25]。而Ca2+、PO43?濃度在C 組較高，但無(wú)差異，與以往研究[26]不完全一致，其不同之處可能在于離子濃度的測(cè)量方法，以往用鄰甲酚酞絡(luò)合劑和自動(dòng)磷鉬酸鹽/紫外分光光度法在半自動(dòng)分析器儀比色測(cè)定。而在本研究中，唾液樣品的離子濃度都是用離子色譜儀分析的，離子色譜操作簡(jiǎn)單、精確度高、分析速度快，在靈敏度、操作、成本等多方面都具有明顯優(yōu)勢(shì)[27]。

圖 4 基于全部唾液生化參數(shù)建立的ECC風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型的性能圖Fig 4 Performance of ECC risk assessment model based on all salivary biochemical parameters

圖 5 基于5個(gè)篩選參數(shù)建立的ECC風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型的性能圖Fig 5 Performance of ECC risk assessment model based on five selected parameters

最后，唾液的生化標(biāo)記物對(duì)有機(jī)體至關(guān)重要，在很多疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用。作為模型中最重要的變量，Cl?在維持電中性方面起著重要作用，其濃度顯著影響了上皮細(xì)胞液體的分泌或吸收速度[28-29]。Mg2+可以作為羥磷灰石礦物組分的取代基，也有助于Ca2+和K+通過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)輸[30]，并且Mg2+通過(guò)減少細(xì)菌毒性因子導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，在預(yù)防牙周疾病和齲齒中發(fā)揮了重要作用。而銨鹽可以中和酸，提高口腔環(huán)境的pH，由作為緩沖物質(zhì)存在于唾液中的尿素被牙菌斑代謝后產(chǎn)生，并且可能由于口腔內(nèi)的反饋調(diào)節(jié)，使患齲兒童口腔內(nèi)NH4+濃度補(bǔ)償性升高。

本研究基于唾液全部生化信息和篩選出的5個(gè)齲病相關(guān)離子，分別建立了ECC 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，區(qū)分ECC 患者和口腔健康者的準(zhǔn)確度可達(dá)85%以上。AUC 值越接近1，提示模型的診斷性能越好。篩選出的5個(gè)參數(shù)的齲病評(píng)估模型與基于全部唾液參數(shù)的齲病評(píng)估模型性能相似，提示利用這5個(gè)離子參數(shù)就可以快速、準(zhǔn)確區(qū)分ECC 患者和健康人群，并且唾液生化參數(shù)對(duì)于ECC 的診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有應(yīng)用潛能。因此，唾液中豐富的無(wú)機(jī)離子可能是口腔微生物的最終代謝產(chǎn)物，對(duì)建立準(zhǔn)確而便捷的齲病診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

本課題組在后續(xù)的研究中將通過(guò)追蹤觀察，研究唾液中這些理化參數(shù)的水平變化能否先于臨床癥狀的表現(xiàn)，將其作為預(yù)測(cè)兒童患齲的有力指標(biāo)，為這些兒童制定個(gè)性化的預(yù)防計(jì)劃。并且，本研究強(qiáng)調(diào)了生化指標(biāo)對(duì)于診斷ECC 的可行性，那么這些參數(shù)指標(biāo)能否普遍適用于不同年齡組的人群以及其他類(lèi)型的口腔感染有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。