益氣活血中藥對良性前列腺增生模型大鼠的治療作用及對前列腺B淋巴細胞瘤-2蛋白表達的影響※

肖友平 阮 明 黃從軍 范 凱

(貴州中醫藥大學第二附屬醫院泌尿外科，貴州 貴陽 550000)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是老年男性常見的泌尿生殖系統疾病之一，臨床表現為膀胱刺激癥狀及梗阻癥狀，可對患者的身體健康及生活質量造成嚴重影響[1]。近年來多項研究表明，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)作為細胞凋亡抑制基因蛋白，在BPH的發病過程中起著重要的作用，通過抑制Bcl-2蛋白表達可以有效抑制前列腺增生[2-3]。中醫學認為，BPH多好發于老年人，腎氣虧虛是其發病之本，氣虛血瘀是其發病的主要原因，益氣活血是臨床治療BPH的主要方法[4-6]。為進一步探討中醫藥治療BPH的作用機制，我們以益氣活血法為治則組方，觀察其對BPH模型大鼠Bcl-2蛋白表達的影響，以期為臨床診療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠90只，10～12周齡，體質量180～220 g，在室溫(20±3)℃、相對濕度40%～60%的實驗室環境下飼養，每日照明持續12 h，自由飲水和進食，由中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0011。

1.2 實驗藥品 益氣活血中藥(藥物組成：黃芪30 g，桃仁20 g，桂枝15 g，茯苓15 g，牡丹皮15 g，川牛膝15 g，荔枝核10 g，肉桂6 g。每劑生藥總量為126 g，由貴州中醫藥大學第二附屬醫院智能顆粒藥房負責加工濃縮制成每劑10.29 g的中藥顆粒制劑)；丙酸睪酮注射液[寧波市第二激素廠，獸藥字(2016)110251054]；非那雄胺片(杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20150142)。

1.3 實驗主要試劑及儀器 Bcl-2免疫組化檢測試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)；電子天平(上海花潮電器有限公司，型號UTP313)；生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號BX-53)；組織包埋盒(江蘇世泰實驗設備有限公司)；Image J圖像分析軟件系統(美國國立衛生研究院)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備 采用雄性激素誘導法進行建立BPH模型大鼠。將90只大鼠隨機分為假手術組(19只)和模型手術組(71只)。所有大鼠均予10%水合氯醛(3.5 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，模型手術組大鼠行雙側睪丸切除術，假手術組大鼠切開外陰皮膚游離但并不切除睪丸，隨后縫合皮膚。所有大鼠均自然飼養恢復1周后，模型手術組大鼠予丙酸睪酮注射液5 mg/kg(以橄欖油10 mL/kg為溶媒)皮下注射，每日1次，連續給藥4周，假手術組大鼠僅予橄欖油10 mL/kg皮下注射，每日1次，連續4周。4周后假手術組及模型手術組分別隨機挑選6只大鼠，處死并取前列腺，通過大鼠前列腺濕質量指數及組織病理變化判斷證實造模成功[7]。

1.4.2 分組及給藥方法 將模型手術組剩余65只大鼠隨機分為模型組、非那雄胺組、中藥低劑量組、中藥中劑量組及中藥高劑量組，每組13只，以及假手術組剩余大鼠13只，共6組。假手術組及模型組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液5 mL/d灌胃，非那雄胺組大鼠非那雄胺片藥液予0.8 mg(kg·d)(以0.9%氯化鈉注射液5 mL為溶媒)灌胃，中藥低、中、高劑量組每日分別予益氣活血中藥顆粒藥液0.85、1.70、2.55 g/(kg·d)(以0.9%氯化鈉注射液5 mL為溶媒)灌胃，均每日1次，連續灌胃4周。

1.5 觀察指標

1.5.1 前列腺濕質量指數 各組大鼠末次灌胃24 h后稱體質量，然后采用脫頸法處死，立即打開腹腔，分離前列腺周圍組織，取出前列腺，去除附帶組織，用濾紙吸干表面液體，并用天平稱取前列腺濕質量，計算前列腺濕質量指數。前列腺濕質量指數=前列腺濕質量/大鼠體質量。

1.5.2 前列腺組織病理觀察 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察前列腺組織病理情況。取部分前列腺組織切片，先放入蒸餾水，然后放入蘇木素水溶液中染色數分鐘，放入酸水及氨水中分色各數秒鐘，水洗1 h后加入蒸餾水中數秒鐘，在70%、90%乙醇中脫水各10 min，酒精伊紅染色2～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，最后將材料周圍多余的液體迅速清除，滴入適量中性樹膠，蓋上清潔蓋玻片，在生物顯微鏡下(×200)觀察前列腺組織病理變化情況。

1.5.3 Bcl-2蛋白檢測 采用免疫組化法檢測Bcl-2蛋白表達情況。將剩余前列腺組織在4%多聚甲醛溶液中固定20 h，脫水后進行石蠟包埋，組織切片。然后按照檢測試劑盒說明，添加一抗體后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗標本，然后滴入二抗體，用二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染、二甲苯透明、中性樹膠封片，在生物顯微鏡下觀察陽性染色，最后采用Image J圖像分析軟件檢測各組大鼠Bcl-2蛋白表達的平均光密度值。

2 結果

2.1 各組大鼠灌胃后前列腺濕質量指數比較 見表1。

表1 各組大鼠灌胃后前列腺濕質量指數比較

由表1可見，與假手術組比較，模型組及中藥低、中劑量組大鼠前列腺濕質量指數均明顯增加，比較差異有統計學意義(P<0.05)，非那雄胺組及中藥高劑量組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，非那雄胺組及中藥中、高劑量組大鼠前列腺濕質量指數均明顯降低，比較差異有統計學意義(P<0.05)，中藥低劑量組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與非那雄胺組比較，中藥低、中劑量組大鼠前列腺濕質量指數均明顯增加，比較差異有統計學意義(P<0.05)，中藥高劑量組與非那雄胺組比較差異無統計學意義(P>0.05)。中藥各劑量組組間比較，中藥高劑量組大鼠前列腺濕質量指數明顯低于中藥低、中劑量組，比較差異有統計學意義(P<0.05)，但中藥低、中劑量組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠灌胃后前列腺組織病理變化情況 假手術組：腺體細胞呈單層矮柱狀排列，大小均勻，排列整齊有序，腺腔無擴張，核仁染色明顯。模型組：腺體細胞排列非常密集，腺腔擴大，腺上皮細胞呈乳頭狀或鋸齒狀向腺腔內突起，間質和小血管水腫，分泌物明顯增多。非那雄胺組：腺體細胞增生不明顯，腺腔基本光滑，間質和小血管擴張較少見。中藥低劑量組：腺體細胞排列致密，腺腔變大，分泌物增多，單層柱狀上皮細胞和高柱狀上皮細胞均可見。中藥中劑量組：腺體細胞輕度增生，腺體排列較整齊，小部分腺體細胞腺腔變大，少量分泌物，但腺腔基本光滑。中藥高劑量組：腺體細胞增生不明顯，排列較整齊，腺腔基本光滑，間質和血管擴張充血水腫較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠灌胃后前列腺組織病理變化

2.3 各組大鼠灌胃后前列腺組織中Bcl-2蛋白光密度值比較 見表2、圖2。

圖2 各組大鼠灌胃后Bcl-2蛋白表達

表2 各組大鼠灌胃后列腺組織中Bcl-2蛋白光密度值比較

由表2可見，與假手術組比較，模型組及中藥低劑量組Bcl-2蛋白光密度值均明顯升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，非那雄胺組及中藥中、高劑量組與假手術組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，非那雄胺組及中藥低、中、高劑量組Bcl-2蛋白光密度值均明顯降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與非那雄胺組比較，中藥低劑量組Bcl-2蛋白光密度值升高，比較差異有統計學意義(P<0.05)，中藥中、高劑量組與非那雄胺組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。中藥各劑量組組間比較，中藥中、高劑量組Bcl-2蛋白光密度值明顯低于中藥低劑量組，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，但中藥中、高劑量組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

BPH是前列腺的一種良性病變，雖然不會對患者的生命健康造成嚴重威脅，但由于前列腺的體積增大、質量增加而導致的尿頻、尿急、排尿困難等癥狀，都會對患者的生活質量及心理健康造成嚴重影響，部分患者甚至需要進行導尿治療[8-9]。隨著我國老齡化社會的到來，BPH的患病率也在逐年增加，不僅給患者及家庭帶來了巨大的經濟負擔，也占據了社會更多寶貴的醫療資源[10]。目前，BPH的病因尚未十分清楚，大量的研究顯示BPH的形成可能與雌激素與雄激素水平比例失衡有關[11]，此外細胞凋亡與抗凋亡基因的異常表達也在BPH的發病過程中具有重要作用，組織病理學上主要表現為腺體細胞增生、腺腔增大、分泌物增多等[12]。近年來，細胞凋亡及其相關基因蛋白在BPH發病機制中的作用成為臨床上研究的熱點。Bcl-2蛋白是目前公認的細胞凋亡抑制因子，在BPH患者中主要由前列腺間質細胞產生，以自分泌的形式調節前列腺間質細胞增殖和凋亡，通過增加雙氫睪酮的作用或調節生長因子發揮作用，其在增生的前列腺組織中表達明顯高于正常的前列腺組織，通過抑制Bcl-2蛋白的表達可明顯控制前列腺組織的增生[13-15]。

中醫學中并無BPH的病名，但根據其排尿困難的主要癥狀表現，可歸屬于癃閉的范疇，并認為小便不利，點滴短少，病勢較緩為癃，小便不通，欲解不解，病勢較急為閉，氣虛血瘀是主要病機。《素問·上古天真論》有言：“丈夫八歲，腎氣實，發長齒更……七八，肝氣衰，筋不能動，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極。八八，則齒發去。”中醫學認為，腎為先天之本，隨著年齡的增長，腎氣漸虧，又腎主水液、主氣化，與膀胱相表里。“膀胱者，州都之官，津液藏焉，氣化則能出矣”(《素問·靈蘭秘典論》)，膀胱儲尿和排尿的功能依賴腎的氣化。腎氣虧虛，則膀胱氣化不利，開闔失度，而出現小便不利、排尿困難等；氣虛不足,推動無力,則血行不暢，瘀滯血脈，停而為瘀。清·王清任《醫林改錯》有言:“元氣既虛,必不能達于血管,血管無氣,必停留而瘀。”清·周學海《讀醫隨筆》有言：“氣虛不足以推血,則血必有瘀。”故治療應以益氣活血為主。桂枝茯苓丸出自漢·張仲景《金匱要略》，具有活血化瘀、消癥散結的功效，是治療婦女行經腹痛、月經不調、產后惡露不盡等婦科疾病的經典名方，現代學者依據異病同治的原則，對其臨床應用進行了拓展研究，現在其臨床應用已經遠遠超出婦科疾病的范疇，近年來大量的研究證實桂枝茯苓丸在男科疾病的治療中也有很好療效[16-18]。我們所用益氣活血中藥就是由桂枝茯苓丸化裁而來，方中黃芪健脾補虛，益氣固表；桃仁活血化瘀，破血行瘀；桂枝溫通經脈，助陽化氣；茯苓健脾寧心，利水滲濕；牡丹皮清熱涼血，活血化瘀；川牛膝補益肝腎，利尿通淋；荔枝核溫中行氣，散結止痛；肉桂補腎助陽，活血通絡。諸藥合用，具有補脾益腎、益氣活血、利尿散結的功效。袁軼峰等[19]研究也證實，益氣活血消癥法能明顯降低BPH模型大鼠前列腺組織中Bcl-2蛋白的陽性表達，促進前列腺組織細胞的凋亡，從而改善BPH的臨床癥狀。

非那雄胺是特異性Ⅱ型5α-還原酶抑制劑，能夠抑制外周睪酮轉化為二氫睪酮，降低前列腺內的二氫睪丸酮，從而抑制前列腺增生，改善BPH臨床癥狀[20]。本研究結果顯示，模型組大鼠灌胃后前列腺濕質量指數及Bcl-2蛋白光密度值較假手術組均明顯升高(P<0.05)，且前列腺組織病理表現出現腺體細胞增生、腺腔擴大、腺上皮細胞呈乳頭狀或鋸齒狀向腺腔內突起等，說明造模成功。各治療組在給予相應藥物灌胃治療后前列腺組織病理表現均有不同程度的改善，其中非那雄胺組及中藥中、高劑量組灌胃后前列腺濕質量指數及Bcl-2蛋白光密度值較模型組均明顯降低(P<0.05)，而中藥低劑量組灌胃后僅Bcl-2蛋白光密度值低于模型組(P<0.05)，非那雄胺組及中藥高劑量組灌胃后前列腺濕質量指數及Bcl-2蛋白光密度值與假手術組相當(P>0.05)，說明益氣活血中藥對BPH具有確切的治療作用，且不同劑量的益氣活血中藥對前列腺Bcl-2蛋白表達均有一定抑制作用，中藥高劑量組的治療效果與非那雄胺相當，并可使前列腺濕質量指數及Bcl-2蛋白光密度值達到正常水平。綜上所述，益氣活血中藥治療BPH療效確切，可明顯抑制BPH模型大鼠前列腺組織增生，改善前列腺組織病理表現，降低前列腺濕質量指數，且治療效果具有一定的量效關系，高劑量的治療效果更好，其作用機制可能與抑制前列腺組織中Bcl-2蛋白表達有關。