鹽酸美沙酮口服溶液微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證研究

嚴(yán)明娟 劉顯玲

鹽酸美沙酮口服溶液微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證研究

嚴(yán)明娟 劉顯玲

目的進(jìn)行鹽酸美沙酮口服溶液的微生物限度檢驗(yàn)方法的構(gòu)建。方法按照2010年版《中國藥典》（二部）的相關(guān)要求，開展微生物限度檢查樣品，分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行。結(jié)果常規(guī)法計(jì)數(shù)霉菌及酵母菌最為合適，但不能用于計(jì)數(shù)本品細(xì)菌；膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基 100ml可應(yīng)用于大腸埃希菌從鹽酸美沙酮口服溶液的檢查過程。結(jié)論培養(yǎng)基稀釋法可測定細(xì)菌數(shù)，常規(guī)法可測定霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)，能將藥物抑菌成分的干擾問題徹底解決，從而使污染存活于藥物中的菌落數(shù)得到可靠反映，具有較高的檢出率。

微生物限度檢查；常規(guī)法；培養(yǎng)基稀釋法；鹽酸美沙酮口服溶液

鹽酸美沙酮口服溶液不僅在戒毒治療方面應(yīng)用廣泛，而且在預(yù)防艾滋病方面也具有降低危害的效果。對于0.12%的防腐劑（山梨酸鉀）非規(guī)定滅菌制劑，在藥品微生物限度檢查法的建立過程中，必須按照2010年版《中國藥典》（二部）的相關(guān)要求，嚴(yán)格驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)及控制菌檢查的方法，以此對所采用方法的適應(yīng)性進(jìn)行確認(rèn)[1]。現(xiàn)回顧報(bào)告如下。

1 材料與試藥

1.1 藥物 鹽酸美沙酮口服溶液（云南省藥物依賴防治研究所，規(guī)格：1ml:1mg，批號：101205、101206、101207各取100ml）。

1.2 菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 由北京三藥科技開發(fā)公司所提供的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸、改良馬丁培養(yǎng)基等培養(yǎng)基。PH710無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.4 儀器 DHP060霉菌培養(yǎng)箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）、100級SW-CJ-1B超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、YXQ-SG-41.280全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（華線醫(yī)用核子儀器有限公司）、PYX-DHS35X40.BS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、303A-2S型隔水式培養(yǎng)箱和遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱（蕭山永發(fā)電器有限公司滬山實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制備

2.1.1 從生理鹽水管取出35℃培養(yǎng)的1ml＋9ml 0.9%金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的24h營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，稀釋按照10-5～10-810倍操作，其細(xì)菌數(shù)大約為50～100cfu·ml-1，以備用計(jì)數(shù)活菌。

2.1.2 從滅菌生理鹽水取出1ml+9ml經(jīng)過35℃培養(yǎng)的 24h白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物，稀釋按照10-6～10倍操作，其細(xì)菌數(shù)大約為50～100cfu·ml-1，以備用計(jì)數(shù)活菌。

2.1.3 將7d經(jīng)過35℃培養(yǎng)的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物取出，然后加入5ml生理鹽水洗下霉菌孢子，并用無菌試管加入經(jīng)過濾的孢子懸液，再從生理鹽水1ml+9ml 0.9%管中將其取出，稀釋按照10-6～10倍操作，存有約為 50～100cfu·ml-1的細(xì)菌數(shù)，以其為計(jì)數(shù)活菌作準(zhǔn)備。

上述株菌全部采用第三代培養(yǎng)物。

2.2 供試品溶液的制備 采取以本品10ml將1:10供試液取出后，將45℃ PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90ml加入。

2.3 驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌落的計(jì)算方法

2.3.1 常規(guī)法 平皿中加入1:10供試液1ml，再加入20ml瓊脂培養(yǎng)基，對其結(jié)果作培養(yǎng)觀察。完成3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)作為驗(yàn)證試驗(yàn)，并對所有試驗(yàn)的各試驗(yàn)菌回收率分別進(jìn)行計(jì)算。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 在5個平皿中平均加入1:10供試液1ml，也就是0.2ml/皿，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基完全注入后，觀察最后的結(jié)果[2]。

2.3.3 測定回收率 ①試驗(yàn)組。完全將 1ml 50～100cfu·ml-1供試液與試驗(yàn)菌液注入。②菌液組。測定試驗(yàn)菌于所有菌株加入的情況。③進(jìn)行對照組供試品的測定。僅加入供試液，采取與試驗(yàn)組大體相同的操作程序，對本菌數(shù)在供試品中的情況進(jìn)行測定。④進(jìn)行對照組稀釋劑的測定。替代供試液可為PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，與試驗(yàn)組大體相同完成其它操作。

2.4 控制菌的檢查 對大腸埃希菌的檢查：可在100ml膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中加注入 1:10供試液10ml，并將大腸埃希菌液1ml一并加入，經(jīng)過35℃下培養(yǎng)24h后再放入，把0.2ml培養(yǎng)物從中取出，其接種培養(yǎng)過程以培養(yǎng)基5ml MUG進(jìn)行實(shí)施，可在35℃環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，于366nm紫外燈下各自進(jìn)行5h、24h的觀察，對照空白MUG培養(yǎng)基的情況。對熒光反應(yīng)進(jìn)行一一觀察，然后滴入靛基質(zhì)試液觀察是否在液面有靛基質(zhì)陽性的玫瑰紅色現(xiàn)象呈現(xiàn)。應(yīng)用金黃色葡萄球菌于陰性菌對照組。

3 結(jié)果

3.1 回收率測定 分別進(jìn)行3次常規(guī)法和試驗(yàn)法得出結(jié)論：回收率達(dá)到70%以上的僅為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉，但枯草芽孢桿菌試驗(yàn)組菌除外。由此可以看出，常規(guī)法計(jì)數(shù)霉菌及酵母菌最為合適，但不能用于計(jì)數(shù)本品細(xì)菌（見表1、2）。

表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌的回收率測定結(jié)果(常規(guī)法)

表2 枯草芽孢桿菌的回收率測定結(jié)果(培養(yǎng)基稀釋法)

3.2 控制菌檢查結(jié)果 試驗(yàn)組陽性MUG和陽性靛基質(zhì)可采用上述方法檢查出來，大腸埃希菌也可從中檢查出來。陰性MUG和陰性靛基質(zhì)是從對照組檢出陰性菌，并未檢出金黃色葡萄球菌。由此可以得出，膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基100ml可應(yīng)用于大腸埃希菌從鹽酸美沙酮口服溶液的檢查過程（見表3）。

表3 大腸埃希菌檢查結(jié)果

4 討論

方法驗(yàn)證是對所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件下供試品的無抑菌作用做確認(rèn)，從而充分檢出供試品所污染的微生物。當(dāng)微生物限度檢查含有抑菌成分藥物的過程中，對試驗(yàn)條件下供試品的抑菌作用本身能夠有效排除提出要求其對染菌的限度檢驗(yàn)不產(chǎn)生干擾作用，且被檢微生物的生長繁殖正常。達(dá)到70%以上的細(xì)菌計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的回收率是《中國藥典》（二部）（2010年版）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定內(nèi)容。在本文，鹽酸美沙酮口服溶液的方法驗(yàn)證試驗(yàn)，分別采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法，結(jié)果顯示，常規(guī)法適用于檢查大腸埃希菌、黑曲霉等，培養(yǎng)基稀釋法是檢查枯草芽孢桿菌唯一的方法，這是抑菌活性在供試品中一定程度的體現(xiàn)。因此，培養(yǎng)基稀釋法可測定細(xì)菌數(shù)，常規(guī)法可測定霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)，能將藥物抑菌成分的干擾問題徹底解決，從而使污染存活于藥物中的菌落數(shù)得到可靠反映，具有較高的檢出率。

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:華齡出版社,2007:223-2271.

R927.1

A

1673-5846(2014)02-0028-02

云南省藥物依賴防治研究所，云南昆明 650228