C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型建立及比較*

張 政，張 欣，付啟航，岳 悅，王雷雷，陳 輝，徐陽陽△

(1.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院放療科，哈爾濱 150000；2.哈爾濱理工大學化學與環境工程學院，哈爾濱 150000；3.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院醫學影像專業，哈爾濱 150000；4.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院泌尿外科，哈爾濱 150000)

近年來，前列腺癌的發病率在全球呈逐年升高的趨勢，已是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前，人們雖然對前列腺癌的治療研究較多，但大多停留在皮下移植瘤模型的層面上，因其在生理結構和疾病發生、發展的過程上都不符合前列腺癌的一般規律，所以模擬效果并不太理想。RM-1前列腺癌原位移植瘤方面，目前主要有兩種移植方式[2-3]，因其生存期短、操作難度較高且對正常組織損傷較大，所以導致模擬結果多具有局限性。本研究通過長期摸索，發現一種新的更適合于實驗研究的成瘤方式。本文旨在對此方法進行介紹，并與其他兩種原位成瘤方式進行比對分析，以探討其實際應用模擬價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選擇C57BL6雄性近交系7周齡(18～20 g)小鼠38只，均購自哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心，飼養環境恒溫、恒濕、清潔、無特殊病原體，允許小動物自由攝取食物和飲水。

1.1.2前列腺癌細胞株

小鼠前列腺癌細胞株系即RM-1細胞株購自中國醫學科學院上海細胞庫，生長于RPMI1640完全培養液中,在5%CO2,37 ℃環境中常規培養。

1.2 方法

1.2.1實驗分組

取2只小鼠進行皮下成瘤，用于原位的腫瘤移植。將余下的36只小鼠隨機分成3組，每組12只。A組為瘤絲注射組、B組為細胞注射組、C組為腫塊移植組。

1.2.2荷瘤小鼠模型的建立

1.2.2.1皮下荷瘤鼠的建立

取2只C57BL6近交系小鼠，剪去小鼠背部毛發，用醫用乙醇清潔小鼠背部，接種制備細胞濃度為2×107個/mL的RM-1前列腺癌細胞，并將其接種于小鼠背部皮下。每只接種100 μL。定期查看腫瘤生長狀況。用于瘤絲注射組和腫塊移植組的腫瘤均取自上述鼠背皮下腫瘤。

1.2.2.2A組模型的建立

用于移植的瘤絲來源于上述荷瘤鼠。取1 mL注射器并抽吸10 μL生理鹽水。將取出的瘤塊置于低溫、無菌的0.9%生理鹽水中，用1 mL注射器針頭輕輕劃撥腫瘤外周，將劃下來的腫瘤絲置于微量注射器尖端，輕輕回抽注射器，以腫瘤絲剛好堵住微量注射器尖端為宜。取出上述C57BL6小鼠12只，用鑷子沾水后，輕輕剔去腹部毛發，用醫用乙醇對小鼠腹部進行消毒。用10%水合氯醛麻醉小鼠,仰臥位,取下腹部正中切口長1.5～2.0 cm,顯露腹腔。輕輕提拉膀胱，暴露前列腺，將頂有腫瘤絲的針頭插入前列腺包膜下，此時注射生理鹽水，將腫瘤絲推入前列腺內，緩慢拔出針頭。恢復器官位置，用6-0單針縫合線分別連續縫合腹肌和皮膚，用聚維酮碘再次對傷口進行消毒處理。待小鼠蘇醒后放回籠中。

1.2.2.3B組模型的建立

取對數生長期RM-1前列腺癌細胞，配成濃度為2×107個/mL溶液。取出上述C57BL6小鼠12只，用鑷子沾水后，輕輕剔去腹部毛發，用醫用乙醇對小鼠腹部進行消毒。從小鼠右下腹緩慢注射10%水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，取仰臥位，沿腹部正中線距離外生殖器約0.5 cm處做1.5～2.0 cm手術切口，顯露腹腔。找出膀胱所在位置，用鑷子輕輕提拉膀胱，推開膀胱底部周圍組織，顯露前列腺，1.5 mm×2.0 mm×2.0 mm大小，分為左右兩葉，有明顯的腺體組織特征，用微量注射器向右側前列腺包膜下注射RM-1細胞懸液10 μL，以包膜和腺體分離，肉眼可見輕微鼓起為標準[2]。恢復器官位置，其余同1.2.2.2。

1.2.2.4C組模型的建立

取出皮下荷瘤鼠的瘤塊，切成直徑1 mm的腫瘤塊。用上述建立細胞注射原位瘤模型的方法找出前列腺，用尖刀分離兩腹側葉，將腫瘤塊置于兩腹側葉間形成的縫隙中用8-0單線縫合針將腫塊與前列腺縫合在一起，輕輕關閉并縫合被摸[3]。恢復器官位置，其余同1.2.2.2。

1.2.3實驗觀察

以小鼠出現嚴重惡病質，瀕死狀態為實驗結束的終點，此時安樂處死小鼠。觀察小鼠成瘤情況，取出肺、腸、肝、脾、腎、胃進行甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察是否有轉移灶。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 3組小鼠成瘤及轉移情況比較

A、B、C組小鼠成瘤率分別為100%、91.67%、91.67%。處死小鼠，解剖打開腹腔，可觀察到腫瘤呈塊狀，3組小鼠均有大量且廣泛的腹腔組織浸潤，膀胱、腹膜均肉眼可見腫瘤侵犯，腹膜后及盆腔淋巴結均已和腫瘤融合成塊，無法分離，滿腹血性液體。且重要的器官如肺、腸、肝、脾、腎、胃均有轉移(圖1)，其中，A、B、C組小鼠肺轉移率分別為83.33%、25.00%、33.33%,肝轉移率分別為75.00%、25.00%、25.00%，A組小鼠的肺、肝轉移率明顯高于B、C組(P<0.05)，B、C組小鼠的肺、肝轉移率比較差異無統計學意義(P>0.05)；3組小鼠的建模成功率和腸、脾、腎、胃器官轉移率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

A：腸；B：肺；C：肝；D：脾；E：腎；F：胃。

表1 3組小鼠建模成瘤及轉移情況比較[n(%),n=12]

2.2 3組小鼠生存時間比較

A、B、C組小鼠生存時間分別為(17.33±2.19)、(14.7±2.39)、(13.58±2.43)d，A組小鼠生存時間明顯長于B、C組(P<0.05)；B、C組小鼠生存時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 3組小鼠成瘤方式操作難度比較

A組要求相對較低。B組成瘤方式易導致細胞液外溢造成人為腫瘤轉移，對術者注射器持握的平穩性要求較高，C組需對前列腺筋膜進行縫合，此操作不僅要求術者具有較好的顯微手術技術，且對小鼠機體有一定的損傷，破壞了原有前列腺生理結構。

3 討 論

長期以來人們對前列腺癌模型的建立多停留在皮下水平，皮下成瘤具有便于觀察、實驗簡便的特點，但不能真實模擬前列腺癌轉移情況[4]。有文獻表明，在超聲低回聲反射陽性時，即臨床檢測懷疑為前列腺癌的時候，41.5%的患者已有轉移[5]。盆腔淋巴結和肺部轉移是晚期前列腺癌患者常見癥狀，也是晚期前列腺癌治療的重點和難點。臨床中前列腺癌患者的主要治療方法為雄激素剝奪治療(ADT)，但效果不甚理想，絕大多數患者都會從激素敏感性前列腺癌(HSPC)發展成為轉移性激素抵抗性前列腺癌(mCRPC)[6-7]。有效地建立晚期轉移性前列腺癌小鼠模型，具有非常高的臨床價值和社會意義[8]。目前臨床中常用CT作為判斷前列腺癌腹腔淋巴結轉移的方式，CT可通過觀察淋巴結大小判斷有無淋巴結轉移。但CT的分辨率較低，小于1 cm的淋巴結難以觀察[9]。有研究表明，前列腺癌在發生周圍組織粘連和侵犯外周器官之前，已有41%的患者發生淋巴結轉移[10]。因小鼠的淋巴結較小，且晚期前列腺癌小鼠腹腔腫瘤浸潤性的轉移粘連，加之滿腹血性腹水使得晚期腹腔淋巴結轉移情況難以觀察。對于此本研究認為，淋巴結轉移觀察的時間窗應控制在腹腔廣泛轉移之前，以減少晚期廣泛粘連對觀察帶來的干擾。

傳統的前列腺原位移植瘤模型建立通常以細胞注射或瘤塊移植的方式進行。通過傳統方式建立小鼠前列腺原位癌模型，雖有很好的成瘤率，但器官轉移率相對較低。不能很好地模擬臨床中晚期前列腺癌多發轉移的情況。而在動物實驗中，藥物實驗往往需要一定的觀察時間窗[11-12]。傳統成瘤方式生存時間短，在藥物療效實驗觀察中有一定的劣勢，有可能藥物尚未發揮作用小鼠便已經死亡，其短暫的生存期限制了藥物方面的觀察研究[13-14]。為此，如何在保持良好成瘤率的前提下，提高腫瘤的轉移率和增加小鼠的存活時間，是當下動物模型構建領域需要解決的問題。本實驗通過瘤絲注射的方式進行原位瘤移植，觀察發現通過瘤絲注射方式進行前列腺癌原位移植可提供較好的成瘤率和器官轉移效果。在生存時間上，瘤絲注射也較傳統成瘤方式明顯延長。

在模型制作難度方面，因小鼠的前列腺癌非常小，只有約1.5 mm×2.0 mm×2.0 mm大小，傳統制作方法對術者精準度要求均較高。使用細胞注射法成瘤，在細胞注射時，稍有不慎，極易使注射液外溢，而注射液為無色腫瘤細胞液，少量溢出時肉眼難以觀察。有文獻表明，注入腫瘤細胞后3周內，有70%的移植瘤模型會出現針道轉移，從而造成人為播散[15]，所以，此方法增加了人為腹腔轉移的風險。手術時需要術者小心謹慎，認真觀察，對注射器持握的平穩性要求較高，是一項難度較高的精準細致的操作。腫塊移植成瘤時，因腫塊肉眼可見，所以一定程度上可以降低腫瘤人為轉移的風險。但因前列腺較小，此操作亦需要全神貫注，小心謹慎，當腫塊放入兩腹側葉間的縫隙后，應小心將筋膜復位，筋膜為一薄層結締組織，縫合需格外小心以確保瘤塊被筋膜嚴密包裹，這需要術者有較好的外科操作技術，且因需對筋膜進行切開再縫合，一定程度上破壞了前列腺原有的組織結構，對小鼠產生了較大的傷害。因此，如何在不改變小鼠解剖結構的前提下，降低模型制作難度，提升成瘤方法的實用性，是當下需要解決的問題。而本實驗所采用的瘤絲注射法，只需將1 mL注射器針頭插入筋膜下，然后注射10 μL生理鹽水，此番操作既不會造成細胞液滲漏導致人為種植轉移，也無需對筋膜進行切開再縫合，不僅降低了操作難度而且減少了人為種植轉移和對小鼠的傷害。

本研究通過新的C57BL6小鼠原位前列腺癌成瘤方法——瘤絲注射法，并于傳統的兩種C57BL6小鼠RM-1前列腺癌原位移植瘤模型進行比對，主要從成瘤率、血道轉移、生存期及操作難度方面進行剖析，客觀的比較了三種成瘤方式的實驗應用價值。總之，瘤絲注射法不僅均具有很好的成瘤率，且對組織損傷小，血道轉移率高，易于操作及普及。其成瘤方式更適合于模擬晚期前列腺癌患者多發轉移的研究，且其生存時間窗相對較長，可以對藥物的治療效果進行更好的評價，具有更高的臨床模擬價值。