新生兒1,25-二羥基維生素D3與CMVI及預后的關系*

邱銳琴，夏明月，韓雁雁，杜志云，姚文秀

(河北省秦皇島市第一醫院：1.新生兒科；2.兒科 066000)

新生兒時期巨細胞病毒感染(CMVI)主要分為圍生期和宮內感染(先天感染，病毒經胎盤傳播)[1]。CMVI的發病機制尚不十分清楚，有研究證實可能與免疫功能異常有關[2]。CMVI后病毒會侵入各種靶器官，包括中樞神經系統、肝臟、眼等，造成多器官損傷，存活者可能會遺留智力障礙、耳聾及其他神經系統后遺癥[3]。因此，對CMVI及其預后進行有效評估，從而針對個體采取治療措施，具有重要臨床意義。1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2D3]是維生素D3的一種活性形式，可調節機體免疫功能及調控腫瘤細胞增殖、分化、凋亡，一定程度上也可反映人體免疫水平[4-5]。但目前并無1,25-(OH)2D3在新生兒CMVI中的研究。因此，本研究通過檢測新生兒血清1,25-(OH)2D3水平，并探討其水平與CMVI及預后的關系，以為評估CMVI及預后提供參考指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月至2019年7月于本院就診的60例初發CMVI新生兒為研究對象(CMVI組)，年齡1～16 d，平均(10.63±3.46)d，男32例，女28例；選取同期75例健康新生兒作為對照組，年齡1～16 d，平均(10.72±3.53)d，男39例，女36例。兩組新生兒年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)CMVI的診斷參照2012年《兒童巨細胞病毒性疾病診斷和防治的建議》[6]；(2)肝炎病毒、風疹病毒、單純皰疹病毒及呼吸道病毒等常見病毒的抗體均呈陰性；(3)臨床病例資料記錄完整清晰者。排除標準：(1)先天性嚴重心、肝、腎功能障礙者；(2)近4周內使用過糖皮質激素等免疫抑制劑者；(3)因其他原因不能參加本研究者。本研究中CMVI均由主治以上醫師明確診斷，本試驗經本院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有受試對象均由專業人員詳細告知家長研究內容并同意參加，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1主要試劑與儀器

1,25-(OH)2D3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：0-119553)、異硫氰酸熒光素(FITC)anti-human CD3(批號：ANT-137)，購自上海將來實業股份有限公司；白細胞介素17(IL-17 )ELISA試劑盒(批號：GTX37136)，購自北京孚博生物科技有限公司；轉化生長因子β1(TGF-β1)ELISA試劑盒(批號：PE051)，購自上海歌凡生物科技有限公司；PE/Cy7-γδT(批號：HT1610611)，購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；FITC anti-human CD4(批號：85-11-0049-71)，購自上海意杰生物科技有限公司；PE anti-human CD25(批號：305445)，購自上海信裕生物科技有限公司。BD FACSCalibur流式細胞儀，購自上海實維實驗儀器技術有限公司。

1.2.2樣品采集及保存

CMVI組于入院后、對照組于體檢時抽取清晨空腹靜脈血樣，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待測；同時用密度梯度離心法獲取單個核細胞，于3 h內采用流式細胞儀檢測。

1.2.3血清1,25-(OH)2D3、IL-17和TGF-β1水平測定

采用ELISA法檢測受試者血清1,25-(OH)2D3、IL-17和TGF-β1水平，操作步驟嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.2.4γδT細胞和Treg細胞表達水平測定

取單個核細胞均分至兩個流式管(管1和管2)，分別加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，重復1次。管1加熒光標記抗體FITC anti-human CD3與PE/Cy7-γδT各5 μL，管2加熒光標記抗體FITC anti-human CD4與PE anti-human CD25各5 μL，混勻，避光孵育15 min，棄上清液，重復1次，加PBS重懸，取200 μL置于流式細胞儀檢測γδT細胞和Treg細胞表達。

1.2.5隨訪

隨訪1年，60例CMVI新生兒中47例臨床好轉或痊愈；2例進行聽覺腦干誘發電位檢查時發現聽覺受損；1例先天性角膜白斑；2例有高熱抽搐發作，腦電圖證實為癲癇，講話口齒不清；8例分別在8個月內死于肝硬化和肝衰竭。根據CMVI新生兒預后情況，將其分為好轉或痊愈組(n=47)和異常或死亡組(n=13)。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組新生兒一般資料比較

兩組新生兒年齡、性別、出生體重、早產比例、分娩方式比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組新生兒一般資料比較

2.2 兩組新生兒1,25-(OH)2D3、TGF-β1、IL-17、Treg、γδT水平比較

CMVI組γδT、IL-17水平高于對照組；1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組新生兒1,25-(OH)2D3及TGF-β1等水平比較

2.3 CMVI新生兒1,25-(OH)2D3與TGF-β1、IL-17等水平的相關性

CMVI新生兒1,25-(OH)2D3與Treg、TGF-β1呈正相關(r=0.532、0.498，P=0.002、0.012)，與γδT、IL-17呈負相關(r=-0.512、-0.476，P=0.008、0.016)。

2.4 不同預后CMVI新生兒1,25-(OH)2D3、TGF-β1等水平比較

異常或死亡組患兒γδT、IL-17水平高于好轉或痊愈組(P<0.05)；1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于好轉或痊愈組(P<0.05)，見表3。

表3 不同預后CMVI新生兒1,25-(OH)2D3、TGF-β1等水平比較

2.5 影響CMVI新生兒預后的多因素分析

將CMVI新生兒是否好轉或痊愈作為因變量，以1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1、γδT、IL-17水平為自變量進行多因素logistic回歸分析。結果顯示，γδT是CMVI新生兒好轉或痊愈的危險因素，1,25-(OH)2D3是CMVI新生兒好轉或痊愈的保護因素，見表4。

表4 影響CMVI新生兒預后的多因素分析

3 討 論

CMVI在我國廣泛流行，且多發生于新生兒時期[7]。巨細胞病毒是一種雙鏈DNA病毒，具有典型的皰疹病毒形態，對免疫系統尚未發育完善的新生兒常表現為顯性感染，可侵害新生兒身體多個臟器，如神經系統、肝臟、肺等，并對免疫缺陷患兒生命造成嚴重威脅[8]。目前，CMVI的病理機制并不明確，但研究表明，免疫細胞和各種細胞因子可能在CMVI的免疫應答過程中發揮重要作用[9]。

維生素是人體必需的一類微量有機物，只能從食物中攝取，參與人體生長、發育及代謝過程[10]。維生素D3是一類脂溶性固醇類維生素，其在人體內的最終活性形式為1,25-(OH)2D3，血清1,25-(OH)2D3可作為衡量人體內維生素D3水平的有效指標[11]。1,25-(OH)2D3不僅可以提高機體對鈣、磷的吸收，促進骨骼鈣化和生長，還可通過調節Th1、Th2和調節性T細胞的細胞活動，誘導細胞優勢免疫應答，從而在機體免疫功能調節中發揮重要作用[12]。本研究結果顯示，CMVI新生兒γδT、IL-17水平高于健康新生兒，1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于健康新生兒，且CMVI新生兒1,25-(OH)2D3與Treg、TGF-β1呈正相關，與γδT、IL-17呈負相關。γδT、Treg、TGF-β1、IL-17均是與炎癥及免疫調節有關的細胞及細胞因子，可穩定機體免疫平衡[13-14]。DAGUZAN等[15]研究發現，γδT細胞在CMVI后數目增多，較對照組升高；徐玲等[16]研究結果顯示，CMVI組γδT和IL-17水平高于對照組，Treg、TGF-β1水平低于對照組，均與本研究結果一致。提示與健康新生兒比較，CMVI新生兒機體炎性反應處于激活狀態，且免疫功能異常，而1,25-(OH)2D3可調節機體免疫功能，推測其可能機制為：(1)當新生兒處于病理狀態時，1,25-(OH)2D3需求量增加，導致其濃度降低；(2)1,25-(OH)2D3分泌量減少使其受體傳遞信號減弱，Th1細胞活動增強，Th2和調節性T細胞活動減弱，從而誘導出Th1優勢免疫應答，介導細胞免疫，誘導免疫排斥，使新生兒發生CMVI。此外，本研究結果中異常或死亡新生兒γδT、IL-17水平高于好轉或痊愈新生兒，1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于好轉或痊愈新生兒，且γδT是CMVI新生兒好轉或痊愈的危險因素，1,25-(OH)2D3是CMVI新生兒好轉或痊愈的保護因素，提示1,25-(OH)2D3與Treg、TGF-β1、γδT、IL-17均與CMVI新生兒的預后有密切聯系，臨床中應尤其注意1,25-(OH)2D3、γδT水平的變化，以便及時采取針對性合理治療措施。

綜上所述，血清1,25-(OH)2D3水平與新生兒CMVI及預后密切相關，臨床上可通過密切監測其水平來評估CMVI及預后，對CMVI新生兒及時采取針對性合理治療措施、改善CMVI預后、降低新生兒病死率可能有指導意義。由于本研究為回顧性研究，存在較多遺失病例，部分因素分析可能不夠全面，還需進一步擴大樣本研究。另外1,25-(OH)2D3影響CMVI及預后的病理機制也需進一步探究。