組織工程學內皮祖細胞膜片制備及生物學功能研究*

薛奮龍，簡鍇陶

(1.天津市第一中心醫院心血管外科 300192；2.天津市胸科醫院心血管外科 300051；3.上海德達醫院心血管外科 200336)

目前，缺血性心臟病(IHD)仍然是全世界病死率最高的疾病。對于IHD導致的慢性心力衰竭的治療已經有了長足的進步，包括β-受體抑制劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體抑制劑等的藥物治療，以及再同步化療[1]。終末期慢性心力衰竭患者也可以進行左心室輔助裝置和心臟移植治療。雖然這些治療方法對于IHD所導致的慢性心力衰竭發揮了重要的作用，但是藥物治療非常有限，預后不佳，左心室輔助裝置受設備和醫療水平限制，無法廣泛的開展，同時心臟移植受供體和受體條件所限，受益人群有限。因此，對于IHD慢性心力衰竭的治療方法仍需要不斷的發展和探索。應用干細胞治療IHD是過去20年間逐步發展的新策略，自體干細胞移植治療IHD的臨床研究已經開展并時有報道[2-3]。可以選擇的干細胞移植種類雖然很多，但無論應用何種干細胞，移植的方式在干細胞治療方案中發揮著至關重要的作用。目前臨床中應用的移植方式主要是在外科手術時心肌內注射或者通過導管冠狀動脈內注射。但通過這些途徑移植的治療效果有限，原因可能與心肌內注射后干細胞只作用在局部區域和注射部位心肌損傷造成移植干細胞生存條件更加惡化有關，導管內冠狀動脈注射干細胞后干細胞隨血流到達損傷部位的干細胞數量有限，治療作用不理想。因此，有學者選擇應用干細胞膜片進行移植，干細胞膜片具有不破壞細胞連接結構，具有更加強大的旁分泌效應[4-5]。干細胞膜片的種類很多，包括心肌干細胞、骨骼肌干細胞、基質干細胞、脂肪干細胞等，但制備和應用內皮祖細胞(EPCs)膜片治療IHD的動物和臨床實驗鮮有報道。本實驗研究大鼠EPCs的制備方法并探討EPCs膜片的生物學功能，以為EPCs膜片移植治療IHD提供參考依據及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗動物。清潔級同種系成年雄性Wistar大鼠15只，8周齡，體重200～250 g，購自軍事醫學科學院動物中心。(2)主要試劑及儀器。內皮細胞基礎培養基及生長因子套裝(EBM-2 Basal Medium)購自美國Lonza公司；淋巴細胞分離液(Histopaque 1083)、大鼠血漿來源玻連蛋白、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)均購自美國Sigma公司；羊抗大鼠CD34流式抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗大鼠CD133流式抗體購自美國Bioss公司；VE-cadherin 抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；KDR抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司;Dil 標記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)購自美國Molecular probes公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)購自瑞士Roche公司；大鼠基質細胞衍生因子1α(SDF-1α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠血管內皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒及大鼠表皮細胞生長因子(EGF)ELISA試劑盒均購自泉州市科諾迪生物科技有限公司。CO2孵育箱購自美國Thermo公司，Nunc UpCell Surface培養皿購自美國Thermo Scientific公司，熒光倒置顯微鏡(IX71)購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國BD FACS Calibur公司。

1.2 方法

1.2.1建立大鼠骨髓來源EPCs(BM-EPCs)培養體系

大鼠BM-EPCs培養體系建立同前期試驗所述[6]，斷頭處死雄性大鼠1只，75%乙醇浸泡2遍，分離股骨和脛骨，用注射器吸取適量的勻漿沖洗液沖洗髓腔至無色，收集懸液到合適離心管中，反復吹打成單細胞懸液，70 μm細胞篩過濾，2 500 r/min離心10 min，棄上清液，加細胞稀釋液重懸細胞，調整細胞濃度至2×108～2×109/mL備用，15 mL離心管加入與骨髓單細胞懸液等量的淋巴細胞分離液Histopaque 1083，緩慢加入細胞懸液，2 100 r/min離心30 min，離心后分四層，取第二層棕黃色單核細胞于15 mL離心管，加入10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻清洗，1 400 r/min離心10 min，EBM-2培養基重懸細胞，接種至纖維連接蛋白包被的培養皿中。在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。4 d后首次全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3天更換新鮮培養液，所有細胞均培養至第14天。

1.2.2大鼠BM-EPCs表面抗原流式細胞術鑒定

棄去培養液，PBS洗滌細胞，0.25%胰酶消化培養至14 d貼壁細胞，1 000 r/min離心3 min，PBS重懸，1 000 r/min離心3 min，細胞計數，PBS調整細胞濃度至1×106個/mL，取200 μL單細胞懸液。設空白對照管、CD34、CD133、KDR、VE-cadherin管，分別加入PBS、CD34、CD133、KDR、VE-cadherin一抗，室溫孵育2 h，流式洗液洗滌1次，加入二抗Alexa Flour488，室溫避光孵育1 h，流式洗液洗滌后行流式細胞儀檢測。

1.2.3EPCs吞噬功能鑒定

將培養至14 d的細胞中加入1 mL完全培養基稀釋的10 mg/L的Dil-acLDL，37 ℃溫箱孵化4 h后，PBS洗滌3次，2%甲醛室溫下固定20 min，再加入1 mL濃度為10 mg/L FITC-UEA-1室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，最后加入1 mL完全培養基稀釋的10 mg/L 的DAPI于37 ℃溫箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙陽性細胞。

1.2.4EPCs膜片建立

取培養至7 d的1.5×106個BM-EPCs接種至包被有玻連蛋白的Nunc UpCell Surface培養皿中，37 ℃溫箱繼續培養7 d后，迅速放置于25 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，獲得大鼠BM-EPCs膜片。

1.2.5細胞膜片厚度測定

棄掉培養至7 d的Nunc UpCell Surface 培養皿中的培養液，加入20 mL 預冷至-20 ℃的甲醇液，4 ℃孵育10 min，1×PBS洗1次，含10% 羊血清的PBS室溫下封閉40 min，PBS-T稀釋一抗ColⅠ共3 mL，室溫孵育4 h，PBS-T洗3次，每次5 min，PBS-T稀釋 Alexa Fluor 488二抗共3 mL，室溫避光孵育1 h，PBS-T稀釋DAPI共3 mL，室溫避光孵育3 min，PBS-T洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察細胞膜片，計算膜片厚度。

1.2.6CCK8法檢測細胞膜片中細胞代謝

分別制備培養至14 d的BM-EPCs單細胞及BM-EPC膜片1×105個/mL細胞懸液，分別設為EPC單細胞組及EPC膜片組。5×103個/孔接種于96孔板中，每組細胞至少接種6個孔，放入培養箱中繼續培養，分別在12、24、48、72 h時用CCK8法檢測細胞活性，每孔加入10 μL CCK8檢測液，在細胞培養箱中孵育4 h后，用酶標儀測定每孔細胞在450 nm處的吸光度(A)。分別繪出EPCs單細胞及EPC膜片的生長曲線。

1.2.7細胞膜片內皮分化功能檢測

4 ℃過夜融化Matrigel，用M199基礎無添加培養基按1∶1稀釋Matrigel，于96孔板中每孔均勻鋪置50 μL Matrigel后，37 ℃溫箱孵育30 min使其凝固。分別重懸BM-EPCs單細胞及細胞膜片，制作成2×105個/mL的細胞懸浮液。分別加100 μL單細胞懸液于Matrigel表面上，37 ℃孵育4 h，顯微鏡下觀察各組細胞形成血管網狀結構，應用Wimasis image analysis軟件分析總的血管環數。

1.2.8ELISA法檢測細胞膜片旁分泌SDF-1α、VEGF、EGF水平

分別取BM-EPCs單細胞及細胞膜片培養上清液，1 000 r/min，離心10 min去除顆粒物及漂浮細胞。按照ELISA檢測試劑盒操作說明設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50 μL；樣本孔分別加入兩組培養上清液50 μL；立即加入50 μL的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL， 用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋孵育 60 min，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿1×洗滌液，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板 5 次。每孔加入底物 A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液 50 μL，15 min內，在450 nm 波長處測定各孔的A值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠BM-EPCs培養體系建立

培養14 d的BM-EPCs在顯微鏡下呈鵝卵石樣排列，局部可見細胞島狀排列，細胞以錘狀、梭形細胞為主，中央區多見多邊形細胞；個別細胞呈線性排列，細胞呈典型紡錘狀，見圖1。

A：鵝卵石樣排列(×100)；B：局部細胞島狀排列(×200)；C：梭形排列(×200)。

2.2 大鼠BM-EPCs鑒定

流式細胞術檢測細胞表面抗原，結果顯示分離培養的BM-EPCs CD34、CD133、KDR、VE-cadherin陽性率分別為85.43%、59.30%、51.83%、38.78%，見圖2。BM-EPCs吞噬功能鑒定顯示，BM-EPCs結合Dil-acLDL后呈紅色，結合了FITC-UEA-1的細胞呈綠色，結合了DAPI的細胞核呈藍色，雙陽性細胞呈黃色，表明其具有EPCs增殖特性，見圖3。

圖2 BM-EPCs細胞表面抗原流式細胞術鑒定

A:吞噬Dil-acLDL的EPCs；B:吞噬FITC-UEA-1的EPCs；C:結合了DAPI的EPCs核；D:吞噬Dil-acLDL和FITC-UEA-1的雙陽性EPCs。

2.3 BM-EPCs膜片建立及膜片厚度測定

單層BM-EPCs膜片的厚度約15 μm，3～4層膜片的厚度約60 μm，見圖4。

A:細胞連接更加緊密的膜片鏡下結構(×200);B:細胞膜片形態(×100)。

2.4 CCK8法檢測細胞膜片中細胞代謝

24 h之內，與EPC單細胞組比較，EPC膜片組中細胞增殖更快(1.59±0.17vs.3.65±0.25，P<0.01)；24 h以后，由于EPC膜片組中細胞長滿96孔板，生長停滯繼而開始凋亡，見圖5。

a：P<0.01，與EPCs比較。

2.5 內皮分化功能檢測

體外血管形成實驗結果顯示，與EPC單細胞組比較，EPC膜片組血管形成能力更強，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

A：EPC單細胞組(×100)；B：EPC膜片組(×100)；C：兩組細胞血管環數比較(n=6)；a：P<0.01，與EPC膜片組比較。

2.6 ELISA法檢測細胞膜片旁分泌因子SDF-1α、VEGF、EGF水平

與EPC單細胞組比較，EPC膜片組細胞旁分泌SDF-1α 和VEGF的能力更強(P<0.05)，而兩組細胞旁分泌EGF的能力比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組細胞旁分泌因子水平比較

3 討 論

血管EPCs主要存在于骨髓及外周血中，不同來源EPCs生物學特征不同。骨髓中含有豐富的EPCs，正常生理條件下BM-EPCs 逐步分化為成熟EPCs到外周血中，通過內皮化和新生血管化參與機體血管損傷修復和維持體內EPCs的內平衡[2]。當內皮細胞發生損傷時，BM-EPCs被動員釋放入外周循環，在不同細胞因子介導趨化下聚集到損傷部位，進行血管再生從而達到修補損傷的作用。自然條件下通過動員自身骨髓，遷移至損傷部位的EPCs數量有限，因此，通過不同的移植方式，增加局部EPCs是促進局部組織修補的有效方法。目前動物實驗和臨床中應用的移植方式主要是在外科手術時心肌內注射或者通過導管冠狀動脈內注射，移植效果欠理想。因此，應用EPCs進行缺血心肌治療時，移植方式起到關鍵性作用，所以，尋求一種有效的干細胞移植方式至關重要[5,7-8]。有研究表明，EPCs在修復組織損傷過程中，可以通過旁分泌機制分泌一些抗炎、促血管生成的因子發揮重要作用，如SDF-1α,VEGF,EGF等[9-10]。由干細胞形成的干細胞膜片具有完整的細胞橋接結構，具有更強的旁分泌機制。目前應用最廣泛的制備干細胞膜片的技術為溫度感應細胞培養板，利用細胞培養皿表面特殊的溫度反應材料在溫差明顯的條件下形成完整片狀結構[4]。多項體外實驗研究表明，間充質干細胞等細胞膜片在皮膚損傷，骨損傷修復及心肌梗死修復表現出理想的結果[11-12]。為達到更佳的治療效果，通過組織工程學方法建立的細胞或干細胞膜片研究逐漸成為臨床研究熱點。

本實驗通過組織工程學方法，獲得EPCs膜片，比較EPCs膜片與EPCs生物學功能的不同。研究結果顯示，EPCs膜片在24 h內，細胞增殖速度比EPCs快，EPCs膜片比EPCs血管生成能力強。局部心肌梗死發生后，細胞壞死并發生炎性反應，釋放大量SDF-1α,BM-EPCs通過SDF-1α/CXCR4體系軸，具有向SDF-1α定向遷移的功能[13]。干細胞在發揮細胞生物學作用時，除了細胞自身發揮作用外，細胞之間的相互作用也非常重要，旁分泌信號通路是細胞間相互聯系最基本也是最重要的組成部分[14-15]。在EPCs膜片中，細胞相互間通過旁分泌細胞因子刺激，增強了細胞生物學功能，與大鼠BM-EPCs單細胞相比，EPCs膜片中細胞旁分泌SDF-1α,VEGF等重要因子的作用更強，這些關鍵因子進一步激活下游信號通路介導并強化相應細胞學生物功能。本研究初步確定了EPCs膜片生物學功能優勢，可為進一步的研究提供了參考。但本研究還存在一些不足，今后將對更多的旁分泌的關鍵因子及其發揮作用的關鍵信號通路進行深入研究。