促紅細胞生成素對短腸綜合征大鼠適應后期Hippo/YAP信號通路及干細胞分化的影響*

尹 光，孔文成，袁文琴，鄭斯鑫，應榮超

(浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院胃腸肛外科 310000)

短腸綜合征(SBS)是指腸道惡性腫瘤等導致小腸需切除，通過切除小腸緩解原有疾病，但術后殘腸小于200 cm，腸道對營養(yǎng)、液體和電解質的吸收減少，導致體重減輕、腹瀉和營養(yǎng)不良等癥狀，影響機體健康[1]。殘腸段若從腸功能衰竭中恢復過來，腸道黏膜吸收面積增加和對營養(yǎng)物質吸收增加，可防止腸衰竭，進而緩解疾病，是治療的關鍵[2]。腸黏膜再生過程中包括多種細胞增殖、分化、凋亡過程，其中干細胞分化在受到外界刺激后，分化為具有特殊結構和功能的終末細胞，可修復并重建小腸黏膜上皮屏障，實現(xiàn)對腸道的保護[3]。因此，促進干細胞定向分化在緩解SBS中具有重要意義。促紅細胞生成素(Epo)可誘導祖細胞增殖分化從而治療疾病，且在臨床上已用于治療SBS[4-5]，但對干細胞影響尚未發(fā)現(xiàn)相關報道。Hippo/Yes相關蛋白(YAP)信號通路中YAP水平降低導致腸道再生受損，活化YAP可促進腸道再生[6]。推測Epo通過影響Hippo/YAP信號通路促進SBS大鼠適應后期干細胞分化，實現(xiàn)對SBS的保護。因此，剪去80%小腸建立SBS大鼠模型，觀察Epo對SBS大鼠適應后期Hippo/YAP信號通路及干細胞分化的影響，可為臨床提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SPF級大鼠28只，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2018-0011，體重200～220 g。飼養(yǎng)條件：12 h/12 h光照/黑暗、(24±0.5)℃溫度、(55±5)%濕度，自由飲水飲食。本研究經本院動物倫理委員會審核并批準。

1.1.2試劑與儀器

Epo購自成都地奧九泓制藥廠(批準文號：國藥準字S19991006，10 000 IU/mL)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天科技有限公司(貨號：C0105)；阿利新藍染液購自武漢賽維爾生物科技有限公司(貨號：G1027)；一抗嗜鉻粒蛋白、抗溶菌酶抗體、YAP、轉錄共激活因子PDZ結合基序(TAZ)均購自英國Abcam公司(貨號分別為：ab15160、ab108508、ab205270、ab224239)。光學顯微鏡購自北京普瑞賽司儀器有限公司(型號：AxioL.A1)；蛋白凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司(型號：4600)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與造模

參考文獻[7]建立SBS大鼠模型，1.0%戊巴比妥鈉緩沖液腹腔注射麻醉大鼠，75%乙醇消毒擦拭皮膚，打開腹腔，剪去80%小腸，只留下約10 cm回腸末端和近端5 cm空腸，空腸6-0縫線縫合，用縫合線逐層縫合切口。手術后，將大鼠單獨放置籠子，隨意飲水，20只大鼠造模，造模成功16只，將其分為模型組、Epo組，每組8只。假手術組8只行腸橫斷再吻合，其余步驟相同。造模后7 d無癥狀，Epo組根據(jù)人與動物用藥量換算[8]，隔日皮下注射157 U/kg Epo[5]，3次/周，持續(xù)2個月；其余兩組注射等體積生理鹽水。

1.2.2大鼠體重情況

分別在術前、術后7 d，藥物治療2個月后稱量大鼠體重。

1.2.3HE染色觀察腸道組織學情況

體重測量結束后，1.0%戊巴比妥鈉緩沖液腹腔注射麻醉大鼠，剖開腹腔，將部分腸道置于4%多聚甲醛中固定，部分置于-80 ℃冰箱中保存待用。經石蠟包埋沿腸腔環(huán)形切片，部分切片HE染色，光學顯微鏡下觀察和拍照，記錄腸黏膜環(huán)狀肌、縱肌厚度，絨毛長度、隱窩深度。

1.2.4阿利新藍染色觀察腸黏膜杯狀細胞情況

部分切片常規(guī)脫蠟，阿利新藍染液染色10 min，蒸餾水漂洗，0.5%中性紅核染3 min。蒸餾水漂洗、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察。

1.2.5免疫組織化學(IHC)觀察腸黏膜內分泌細胞、潘式細胞情況

部分切片經脫蠟、水化、抗原熱修復等步驟后，滴加一抗嗜鉻粒蛋白、抗溶菌酶抗體，4 ℃過夜后，加入對應二抗，蘇木精復染，水洗、脫水、透明、封片。顯微鏡下拍照觀察細胞形態(tài)。嗜鉻粒蛋白陽性標志內分泌細胞、抗溶菌酶抗體陽性標志潘式細胞。細胞相對數(shù)量=該細胞數(shù)量/隱窩中細胞總數(shù)×100%。

1.2.6Western blot檢測腸組織YAP、TAZ蛋白表達水平

取出-80 ℃保存的部分腸道組織，蛋白裂解液裂解提取腸組織總蛋白。凝膠電泳分離蛋白質、NC膜轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，對應加入一抗YAP、TAZ、GAPDH，4 ℃孵育過夜；加入對應二抗室溫孵育1 h。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 3組大鼠一般情況

假手術組術后僅在第1天出現(xiàn)腹瀉，之后恢復良好；模型組和Epo組在術后前3 d均出現(xiàn)大便不成形、腹瀉情況。

2.2 3組大鼠手術前后體重比較

術前3組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后7 d，與假手術組比較，模型組、Epo組體重降低(P<0.05)。治療2個月后，與假手術組比較，模型組體重降低(P<0.05)；與模型組比較，Epo組體重增加(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠手術前后體重比較

2.3 3組大鼠腸黏膜形態(tài)比較

假手術組黏膜、黏膜下層、肌層層次清晰，黏膜上皮完整清晰；模型組黏膜腺體較多，出現(xiàn)細胞浸潤現(xiàn)象；Epo組肌層層次較清晰、細胞浸潤現(xiàn)象緩解。與假手術組比較，模型組、Epo組環(huán)狀肌、縱肌厚度，絨毛長度、隱窩深度均增加(P<0.05)；與模型組比較，Epo組環(huán)狀肌、縱肌厚度，絨毛長度、隱窩深度均增加(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 3組大鼠腸黏膜形態(tài)學情況

表2 3組大鼠腸黏膜相關指標比較

2.4 3組大鼠腸黏膜干細胞分化情況比較

與假手術組比較，模型組杯狀細胞、潘式細胞相對數(shù)量降低(P<0.05)；與模型組比較，Epo組杯狀細胞、潘式細胞相對數(shù)量升高(P<0.05)，見圖2、表3。

表3 3組大鼠腸黏膜干細胞分化情況比較

圖2 3組大鼠腸黏膜干細胞分化情況(IHC,×400)

2.5 3組大鼠腸組織YAP、TAZ蛋白水平比較

與假手術組比較，模型組YAP、TAZ蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，Epo組YAP、TAZ蛋白水平升高(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 大鼠腸組織YAP、TAZ蛋白表達水平

表4 3組大鼠腸組織YAP、TAZ蛋白水平比較

3 討 論

SBS中腸黏膜受多種信號通路影響，持續(xù)經歷增殖、分化和凋亡等過程。其中干細胞可分化為所有細胞，包括吸收性細胞(如腸上皮細胞)、分泌性細胞(杯狀細胞、內分泌細胞、潘式細胞)[9]。分泌性細胞中促進杯狀細胞生成可增加腸黏膜黏液量，減少共生細菌易位[10-11]；潘氏細胞分泌的防御素等抗微生物肽具有抵抗病原微生物、重塑腸道微生物群落、保護腸道干細胞等功能[12]。因此，促進干細胞分化可緩解SBS。Epo是一種含唾液酸的酸性糖蛋白激素，在肝硬化大鼠模型中術前Epo治療可促進肝細胞再生，從而提高肝切除術后的生存率[13]；在大鼠肝缺血再灌注模型中Epo預處理，可減少小腸黏膜損傷和炎性反應，延緩上皮細胞壞死、炎癥浸潤、毛細血管出血等癥狀，從而減輕腸黏膜屏障損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組大鼠出現(xiàn)腹瀉、體重減輕癥狀，杯狀細胞、潘式細胞相對數(shù)量下降；環(huán)狀肌、縱肌厚度，絨毛長度、隱窩深度均增加，與馮登宇等[15]研究結果類似，提示SBS后雖然腸道自身出現(xiàn)適應性，通過增加環(huán)狀肌、縱肌厚度，增加絨毛長度和隱窩深度緩解SBS對機體的損害，但腸道菌群紊亂嚴重，仍出現(xiàn)腹瀉癥狀；干細胞分化受限，營養(yǎng)物質等吸收減少，機體自身調節(jié)能力有限，造成體重減輕，疾病加重。治療2個月后，與模型組比較，Epo組體重增加(P<0.05)，杯狀細胞、潘式細胞相對數(shù)量增加，環(huán)狀肌、縱肌厚度，絨毛長度、隱窩深度均增加(P<0.05)。提示Epo可在自身調節(jié)基礎上通過促進干細胞分化進一步增加環(huán)狀肌、縱肌厚度，增加絨毛長度、隱窩深度，增加腸黏膜吸收面積和對營養(yǎng)物質吸收，從而實現(xiàn)對SBS大鼠的保護。

Hippo/YAP信號通路最初在研究果蠅組織生長中發(fā)現(xiàn)，異常表達表型與海馬相似而命名[16]。上游機械信號、細胞應激、細胞極性等刺激可誘發(fā)Hippo信號通路發(fā)揮作用，Hippo信號通路中激酶級聯(lián)反應可活化其他因子從而促進效應分子YAP/TAZ發(fā)揮作用，活化的YAP/TAZ與細胞質中14-3-3蛋白結合，YAP/TAZ滯留在細胞質中無法進入細胞核，而喪失輔助因子[17-18]。當Hippo信號通路被抑制時，YAP/TAZ無法活化或與下游因子結合，進而阻止YAP/TAZ發(fā)揮其作用[19]。同時Hippo/YAP-TAZ信號通路又不是獨立的，與轉化生長因子(TGF)超家族TGF-β/Smads，Wnt/β-鏈蛋白(β-Catenin)和表皮生長因子受體(EGFR)/絲裂原相關蛋白激酶等信號轉導途徑級聯(lián)，共同調節(jié)細胞增殖、細胞分化等過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組腸組織YAP、TAZ蛋白水平降低，提示SBS大鼠腸道中可能由于菌群紊亂、炎癥浸潤、細胞壞死等現(xiàn)象，導致YAP、TAZ蛋白表達受到抑制，對腸道干細胞的分化作用減弱，干細胞分化受限，絨毛長度增長、隱窩深度變深受到限制，腸道黏膜吸收面積和對營養(yǎng)的吸收有限，從而加重疾病。與模型組比較，Epo組YAP、TAZ蛋白水平升高，提示Epo作用于機體后，可緩解YAP、TAZ蛋白減少現(xiàn)象，高表達YAP、TAZ蛋白促進干細胞分化，增加腸道黏膜面積，實現(xiàn)對疾病的保護。

綜上所述，Epo可激活Hippo/YAP信號通路，促進干細胞分化，實現(xiàn)對SBS大鼠的保護。但Hippo/YAP下游信號通路眾多，具體通過哪些下游信號通路調控干細胞分化尚不清楚，還有待進一步研究。