前列腺癌組織中LncRNA TUG1表達及其與臨床預后的相關性研究*

郝思達，馬健雄，顧 海，王業強，秦 勇

(浙江省中西醫結合醫院/杭州市紅十字會醫院：1.泌尿外科 ；2.生殖科，杭州 31000)

前列腺癌是男性常見生殖系統惡性腫瘤之一，多見于中老年人群，致死率約占男性惡性腫瘤死亡總數的1.26%，且隨著年齡增長而不斷升高[1]。外科手術是當前治療前列腺癌最主要也是最有效的方法，但因其浸潤性較強，術后復發率及轉移率較高，臨床預后仍不理想[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長度大于200個核苷酸的RNA，且無編碼蛋白質功能，已被證實在多種惡性腫瘤的發生及發展過程中具有重要調節作用[3]。有研究顯示，LncRNA牛磺酸上調基因1(TUG1)可結合部分甲基化蛋白而參與細胞生長的調控，且被證實在結直腸癌[4]、肝細胞癌[5]等惡性腫瘤中明顯高表達，且可能導致部分抑癌基因如磷酸酶基因(PTEN)等丟失而參與腫瘤的發生及發展[6]，但其在前列腺癌發生、發展中的作用及確切分子機制仍缺乏充分研究。本研究檢測了前列腺癌患者癌組織中LncRNA TUG1表達水平，并探討其與患者臨床病理特征、臨床預后的關系，旨在為前列腺癌的早期診療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2017年1月在本院住院治療的前列腺癌患者126例。納入標準：(1)經病理活檢及術后病理檢查確診為前列腺癌；(2)具有完整的臨床病理資料、隨訪資料；(3)獲得腫瘤組織及癌旁正常組織(與腫瘤邊緣距離大于5 cm)。排除標準：(1)繼發性前列腺癌患者；(2)合并其他惡性腫瘤、合并自身免疫性疾病者；(3)術前接受新輔助化療、放療或其他抗腫瘤治療者；(4)組織反復凍存或污染者。入組患者和(或)其家屬均知情同意且簽署書面知情同意書，研究方案經醫院倫理學委員會審核且批準通過。納入患者年齡45～78歲，平均(66.21±6.43)歲；術前血清前列腺特異抗原(PSA)0.19～100 μg/L，平均(12.64±3.03)μg/L；腫瘤直徑：<3.0 cm者71例，≥3.0 cm者55例；美國癌癥聯合會(AJCC)分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期75例；腫瘤T分期：T1～2期者47例，T3～4期者79例；分化程度：中/高分化62例，低分化或未分化64例；術前淋巴結轉移31例。

1.2 方法

1.2.1主要儀器與試劑

(1)儀器：DS-11型微量分光光度計購自美國DeNovix公司；凝膠電泳分析系統購自美國Lonrmat公司；7500型實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司。(2)試劑：cDNA 合成試劑盒購自美國Bio-miga公司；2×Taq PCR MasterMix 試劑盒及2×SYBR Green Mix(With ROX)試劑盒均購自美國Bio-miga公司；10%胎牛血清(FBS)購自杭州仟諾生物科技有限公司；RPMI-1640 培養基購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；亂序對照小干擾RNA(Si-NC)和TUG1小干擾RNA(si-TUG1)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.2RT-PCR法檢測組織LncRNA TUG1、PTEN表達

組織標本采用10%甲醛液固定，石蠟包埋，切片厚度5 μm。組織加入液氮并充分研磨，采用Trizol法分離、提取RNA。采用無RNase的DNaseⅠ去基因組進行處理，37 ℃ 30 min，65 ℃滅活10 min，反應體系包括3 020 μL DNaseⅠ、60 μL RNA、100 μL無RNase水、20 μL 10×buffer。取上述RNA樣本，稀釋60倍后以微量分光光度計檢測RNA純度，分別測定波長260 nm、280 nm處OD值，OD260/OD280>1.8判定為RNA純凈。取模板RNA及引物混合物加入PCR管中，加入無RNase水定容至12.0 μL，70 ℃處理10 min后立即置于冰面上放置2 min合成cDNA，反應體系包括：4.0 μL 單蒸水、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、10 μL SYBR?Premix ExTaq TM(TliRNaseH Plus)(2×)及5.0 μL cDNA，啟動PCR反應測定組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對表達水平，內參分別為GAPDH、β-actin。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，循環40次；72 ℃終延伸5 min。采用2-△△CT法計算目標基因的相對表達強度，引物序列設計見表1。

表1 引物序列設計

1.2.3細胞轉染

取正常組織細胞及前列腺癌細胞PC-3(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心)分別接種到RPMI-1640培養基中，置于5% CO2環境(37 ℃恒溫)培養細胞。按照1∶5傳代，培養5～7 d經顯微鏡觀察顯示生長匯合度達80%左右，選取穩定生長對數期細胞進行轉染。細胞采用含10% FBS的RPMI-164培養基，置于5% CO2、37 ℃恒溫環境下培養。消化后以3×105個/孔在6孔細胞板中種植，設計空白組、陰性轉染組與轉染組，分別加入無血清培養基、50 nmol/L Si-NC、50 nmol/L si-TUG1，按照Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)說明書進行轉染。溫育24 h后，提取PTEN總RNA進行RT-PCR法檢測，操作同1.2.2。

1.2.4治療與隨訪

所有患者均根據《前列腺癌診斷治療指南》(2014年)[7]推薦的前列腺癌治療方案進行術后對癥治療，包括化療、放療及不良反應防控等。隨訪統計術后3年復發/轉移率及癌因性病死率，隨訪截止日期為2020年4月1日或死亡。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 癌組織及癌旁正常組織中LncRNA TUG1和PTEN mRNA的相對表達水平比較

前列腺組織中LncRNA TUG1相對表達水平明顯高于癌旁正常組織，約為正常組織的3.54倍；而PTEN mRNA相對表達水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.001)，見表2。相關性分析顯示，癌灶組織中LncRNA TUG1與PTEN mRNA表達水平呈明顯負相關性(r=-0.689，P<0.001)。

表2 兩組標本組織中LncRNA TUG1和PTEN mRNA的相對表達水平比較

2.2 3組PC-3細胞LncRNA TUG1和PTEN mRNA的相對表達水平比較

轉染組PC-3細胞中的LncRNA TUG1的相對表達水平明顯低于空白組和陰性轉染組(P<0.05)；PTEN mRNA相對表達水平明顯高于空白組和陰性轉染組(P<0.05)，約為轉染前的1.29倍；空白組和陰性轉染組兩指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 3組PC-3細胞LncRNA TUG1和PTEN mRNA表達水平比較

2.3 LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對表達水平與前列腺癌患者臨床病理特征的關系

不同年齡、腫瘤大小患者的癌組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，但不同T分期、AJCC分期、分化程度及是否淋巴結轉移患者比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對表達水平與臨床病理特征的關系

2.4 不同臨床轉歸患者癌組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對表達水平比較

126例患者術后隨訪1～60個月，中位隨訪時間為36.5個月。1、3年存活率分別為80.95%(102/126)、69.05%(87/126)，復發/轉移率為40.48%(51/126)。復發/轉移患者的癌組織中LncRNA TUG1相對表達水平明顯高于無復發/轉移患者，且在死亡患者中LncRNA TUG1相對表達水平明顯高生存患者(P<0.001)；復發/轉移患者的癌組織中PTEN mRNA相對表達水平明顯低于無復發/轉移患者，且在死亡患者中PTEN mRNA相對表達水平明顯低于生存患者(P<0.001)，見表5。

表5 不同臨床轉歸患者癌組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA表達水平比較

2.5 前列腺癌患者生存影響因素的Cox回歸分析

Cox回歸分析顯示，AJCC分期、T分期、分化程度、淋巴結轉移、LncRNA TUG1表達水平均是影響前列腺癌患者生存狀況的獨立危險因素(P<0.05)，PTEN mRNA表達水平是其保護性因素(P<0.05)，見表6。

表6 前列腺癌患者生存影響因素的Cox回歸分析

3 討 論

LncRNA是非編碼RNA的重要構成，廣泛分布于人體各個臟器及細胞中，參與多種復雜基因表達的調控。目前，已有諸多研究證實，LncRNA參與多種惡性腫瘤的發生及發展過程，可能作為腫瘤進展過程中的抑癌或致癌基因而存在[8]。有研究顯示，LncRNA能夠內源性競爭miRNA而參與上皮間質轉化(EMT)相關轉錄因子表達的調控，從而影響EMT進程，進而影響腫瘤細胞的侵襲、轉移過程[9]。LncRNA中TUG1是廣泛表達于多種組織細胞中的基因，最早發現于發育中視網膜及神經組織中，近年有不少研究發現LncRNA TUG1參與了膀胱癌、腎癌等泌尿系統惡性腫瘤的發生及發展[10-11]。然而，有關LncRNA TUG1表達在前列腺癌中的作用、可能機制及與臨床預后的關系方面尚缺乏充分研究報道。

本研究結果顯示，前列腺癌組織中LncRNA TUG1相對表達水平相較于癌旁正常組織明顯升高，約為正常組織的3.54倍，提示LncRNA TUG1過表達可能參與前列腺癌的發生、發展。進一步檢測抑癌基因PTEN的表達顯示，前列腺癌組織中PTEN mRNA相對表達水平明顯低于正常組織(P<0.05)，與陸巍等[12]報道相符，提示PTEN功能缺失可能參與前列腺癌的發病過程。鑒于LncRNA TUG1與PTEN在前列腺癌中分別發揮促癌與抑癌作用，推測LncRNA TUG1過表達可能通過調節抑癌基因PTEN表達而參與前列腺癌的發生及發展。為此，本研究通過在PC-3細胞中轉染si-TUG1抑制LncRNA TUG1表達后顯示，轉染組的PTEN mRNA相對表達水平明顯升高，表達水平約為轉染前的1.29倍，提示在前列腺癌中LncRNA TUG1可能抑制PTEN的表達，從而影響其抑癌作用，而PTEN的丟失進一步誘發前列腺癌或引起癌癥進展。DU等[13]研究亦發現，IncRNA TUG1可調節前列腺癌中PTEN表達而參與腫瘤的發生及發展，這與本研究結論相符。進一步Pearson相關性分析顯示，本組前列腺癌組織中LncRNA TUG1與PTEN mRNA相對表達水平呈明顯負相關(r=-0.689,P<0.001)，表明前列腺癌組織中LncRNA TUG1過表達增強了其對PTEN表達的抑制作用，導致PTEN功能丟失而引起前列腺癌的發生及發展。但前列腺癌組中LncRNA TUG1過表達是否與PTEN丟失直接相關或存在濃度依賴關系還有待進一步深入研究。

本研究進一步驗證LncRNA TUG1表達水平與前列腺癌患者臨床病理特征之間的關系顯示，T3～4分期、Ⅲ～Ⅳ期患者具有更高的LncRNA TUG1表達，且在未、低分化患者中其相對表達水平高于中、高分化患者，T3～4期者的LncRNA TUG1相對表達水平明顯高于T1～2期患者，在伴發淋巴結轉移患者中具有更高的LncRNA TUG1表達。提示LncRNA TUG1表達可能與前列腺癌患者的腫瘤侵襲性、惡性程度有關，LncRNA TUG1過表達可能增強其遷移、侵襲行為，而腫瘤遷移、侵襲能力的增強可能增加遠期復發、轉移風險，導致遠期預后不良，文獻[14-15]報道也驗證了本研究結論。同時，PTEN表達顯示出了與LncRNA TUG1相反的變化特征，PTEN低表達或缺失與腫瘤侵襲性、惡性程度有關。推測LncRNA TUG1高表達及PTEN丟失可能與前列腺癌患者的不良生物學行為密切相關，二者相互影響均可能增加遠期不良預后風險。隨訪結果顯示，前列腺癌患者術后復發/轉移率為40.48%，3年生存率為69.05%，高于楊勇等[16]報道的3年生存率29.8%，可能與樣本差異及病情程度不一等有關。比較存活與死亡患者的LncRNA TUG1、PTEN mRNA表達水平顯示，死亡患者的LncRNA TUG1相對表達水平明顯高于存活者，PTEN mRNA明顯低于存活患者(P<0.001)，提示LncRNA TUG1高表達及PTEN丟失與前列腺癌患者的遠期預后存在一定的關系，這與董云益等[17]研究結論相符。進一步Cox分析顯示，AJCC分期(Ⅲ～Ⅳ期)、T3～4期、分化程度(未、低分化)、淋巴結轉移、LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對表達水平均是影響前列腺癌患者生存狀況的獨立危險因素(P<0.05)。考慮為LncRNA TUG1過表達可能影響抑癌基因的表達，進而影響癌細胞的增殖遷移，加速癌細胞生長，增加其浸潤、轉移風險，故可能增加不良預后發生風險。

綜上所述，本研究通過檢測前列腺癌癌灶組織中LncRNA TUG1及抑癌基因PTEN表達并分析其與前列腺癌臨床病理特征、預后間的關系發現，TUG1過表達參與了前列腺癌的發生、發展，且可能通過抑制PTEN表達而誘導癌細胞增殖、分化、侵襲、轉移等惡性生物學行為，且過表達TUG1可能促進前列腺癌的復發轉移，進而影響臨床預后。因此，TUG1有望作為前列腺癌的潛在分子標志物，對前列腺癌的診治及預后預測均具有參考意義。但本研究樣本較小，且缺乏對其可能機制的研究，還需進一步深入研究加以完善。