紅花治療動脈粥樣硬化潛在靶點及機制

張玉婕， 朱靜華， 王祖祿， 閆承慧， 韓雅玲

1.北部戰區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽110016；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847

心血管并發癥是世界范圍內死亡的主要原因，大多心血管并發癥的潛在病理生理學是動脈粥樣硬化[1]，特征為大中型血管中形成富含脂質的斑塊，動脈粥樣硬化是動脈壁的一種慢性炎癥性疾病[2]。紅花為菊科植物紅花的干燥花，性溫，味辛，歸心、肝經，具有活血通經、散瘀止痛之功效，用于治療經閉、痛經、惡露不行、癥瘕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛等[3]。有研究表明，在治療動脈粥樣硬化中，紅花具有抗炎、抗血小板聚集、抗缺血作用，但具體機制不明[4]。網絡藥理學基于系統生物學理論，對藥物有效成分進行多靶點、多途徑的生物系統網絡圖分析[5]。從中醫學角度闡明中藥成分-靶點-疾病基因之間的關系、尋找發揮治療作用的關鍵靶點及通路可為疾病的臨床治療提供理論依據。本研究通過網絡藥理學的方法篩選紅花中的有效化學成分，預測其與動脈粥樣硬化相關的靶點及信號通路。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 紅花化學成分及靶點收集 紅花的化學成分及靶點通過傳統中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲得。該數據庫和分析平臺包括化學成分、靶點、藥物-靶點網絡、相關的藥物-靶點-疾病網絡，以及天然化合物的藥代動力學特性，如口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、類藥性(drug-likeness，DL)、血腦屏障等[6]。根據吸收、分布、代謝和排泄篩選化學成分，并利用藥代動力學信息檢索篩選出閾值OB≥30.00%、DL≥0.18的化學成分進一步分析[7-8]。經TCMSP檢索的靶蛋白通過蛋白數據庫(Uniprot；https://www.uniprot.org/)[9]將蛋白名稱轉換為基因ID名稱。

1.2 動脈粥樣硬化靶點收集動脈粥樣硬化相關的疾病靶基因 從DisGeNET和GeneCards數據庫中獲得靶基因，去除重復的靶點。通過ImageGP平臺將紅花中有效成分對應的靶點和動脈粥樣硬化的疾病靶點進行匹配重合[10]，繪制韋恩圖，獲得紅花中具有治療動脈粥樣硬化作用的關鍵靶點。

1.3 靶蛋白相互作用網絡圖構建 采用STRING數據庫(https://string-db.org/)[11]進行靶蛋白相互作用網絡圖的構建，將紅花與動脈粥樣硬化共同的靶點導入STRING數據庫，物種設置為“Homo Sapiens”，獲得靶點相互作用信息。將結果導入到Cytoscape軟件[12]，繪制并分析交互網絡，設置網絡中節點大小、顏色深淺與Degree值相對應，即節點越大、顏色越深代表Degree值越高。

1.4 生物功能注釋基因富集分析和基因組百科全書代謝通路富集分析 采用Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[13]對紅花治療動脈粥樣硬化的關鍵靶點進行生物功能注釋(Gene Ontology，Go)基因富集分析和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)代謝通路富集分析，分析紅花中的主要分子生物過程和信號通路，其中，Go富集和KEGG通路富集分析的結果均以條形圖的形式進行展示。

2 結果

2.1 紅花活性成分篩選 紅花的化學成分有23個，其中，16個化學成分滿足OB≥30.00%、DL≥0.18(表1)。

表1 紅花有效活性成分表

2.2 紅花活性成分的潛在靶點預測 紅花中有449個預測靶點，剔除重疊靶點后，得到178個靶點。具有靶點最多的活性成分是槲皮素，然后依次是木犀草素、山奈酚、黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇，靶點個數分別為128、57、51、30、27、23個。

2.3 動脈粥樣硬化潛在靶點預測 紅花中具有治療動脈粥樣硬化作用的關鍵靶點有55個(圖1，表2)。

圖1 紅花與動脈粥樣硬化靶基因匹配圖

表2 紅花潛在靶點信息列表

2.4 紅花與動脈粥樣硬化共同靶點分析 將紅花與動脈粥樣硬化共同的55個靶點導入STRING數據庫，獲得了包含55個節點和850條邊的網絡圖，平均節點度值為30.91。Cytoscape軟件構建蛋白質相互作用網絡，關聯強度前10位的靶點分別是白細胞介素-6、白蛋白、腫瘤壞死因子、血管內皮生長因子、白細胞介素-8、趨化因子2、蘇氨酸激酶1、前列腺素內過氧化物合酶2、基質金屬蛋白酶9、白細胞介素-1β(圖2)。

2.5 關鍵靶基因Go分析 Go-細胞成分分析可見，富集前9位細胞成分主要是小窩蛋白、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、細胞外基質、分泌顆粒腔隙、內質網內腔、富含Ficolin-1顆粒腔、蛋白質-基因復合物、質膜外側、質膜蛋白復合物(圖3a)。Go-分子功能分析可見，富集前10位分子功能主要是細胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、細胞核受體活性、絲氨酸型內肽酶活性、血紅素結合、整合素結合、磷酸酶結合、蛋白酶結合、蛋白質同源二聚體活性、蛋白激酶結合(圖3b)。Go-生物學過程分析可見，富集前10位生物學過程主要是細胞因子調節的信號通路、對脂多糖的反應、氧化應激反應、細胞遷移的正調控、活性氧代謝過程、白細胞-細胞粘附的調節、白細胞遷移、對有毒物質的反應、對細胞外刺激的反應、凋亡信號通路的調控(圖3c)。

圖2 紅花治療動脈粥樣硬化的靶點相互作用網絡

2.6 關鍵靶基因KEGG分析 對55個關鍵靶基因進行KEGG分析，并以P<0.01為閾值篩選出前10條通路，分別為流體剪切應力與動脈粥樣硬化、白細胞介素-17信號通路、瘧疾、癌癥途徑、HIF-1信號通路、弓形蟲病、丙型肝炎、T細胞受體信號通路、癌癥中的轉錄失調、HTLV-Ⅰ感染(圖4)。

圖3 紅花有效化學成分潛在靶點Go分析(a.細胞成分分析；b.分子功能分析；c.生物學過程分析)

圖4 紅花有效化學成分潛在靶點KEGG分析

3 討論

動脈粥樣硬化是臨床常見疾病，致病過程復雜，中醫根據其臨床癥狀將其歸屬于“中風”“眩暈”“偏枯”等范疇[14]。中藥紅花對心肌缺血、心肌梗死等心血管疾病具有良好的療效，但關于其治療動脈粥樣硬化相關靶點和信號通路的研究較少。

本研究發現，紅花中具有治療動脈粥樣硬化作用的化學成分主要是槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇等。炎癥和氧化應激反應在動脈粥樣硬化的發生和發展中起著重要作用。有研究報道，槲皮素可通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路抑制炎癥和氧化應激反應，進而減輕糖尿病高脂飲食誘導的大鼠頸動脈粥樣硬化[15]。木犀草素是一種存在于多種藥材中的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗纖維化等藥理作用。木犀草素能夠通過調節信號轉導子和轉錄激活子3介導的炎癥反應來改善高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化[16]。氧化低密度脂蛋白會誘導內皮細胞凋亡，參與動脈粥樣硬化的發生和發展，山奈酚通過抑制TLR4/NF-κB通路上調miR-26a-5p，減輕氧化低密度脂蛋白誘導的內皮細胞凋亡，防治動脈粥樣硬化[17]。黃芩素是一種有效的抗動脈粥樣硬化的化合物，可通過調節氧化應激反應發揮作用[18]。

紅花可通過調節多個靶點，如白細胞介素-6、白蛋白、腫瘤壞死因子、血管內皮生長因子、白細胞介素-8、趨化因子2、蘇氨酸激酶1等靶蛋白在改善動脈粥樣硬化中發揮作用。通過對紅花抗動脈粥樣硬化的核心靶點進行KEGG分析發現，紅花主要通過流體剪切應力與動脈粥樣硬化、白細胞介素-17信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路等治療動脈粥樣硬化。NF-κB介導的炎癥反應通路在動脈粥樣硬化的形成和發展中發揮重要作用[19]，NF-κB活性增強能夠促進白細胞介素-6、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子等細胞因子表達，損傷血管內皮損傷，促進單核巨噬細胞向血管內皮細胞粘附[20]。血管內皮生長因子可促進內皮細胞增殖、巨噬細胞浸潤、泡沫細胞形成，影響動脈粥樣硬化發病[21]。白細胞介素-8是一種炎癥因子，G31P可拮抗白細胞介素-8受體，通過調節Rho激酶、ERK和鈣依賴通路抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移[22]。單核細胞和中性粒細胞在動脈粥樣硬化病變的早期積聚，白細胞的積聚受到其與激活內皮細胞相互作用的調控，這種調控由內皮細胞粘附分子、趨化因子及其各自的受體協調發揮作用，動脈血管趨化因子2表達上調會促進白細胞向動脈粥樣硬化病變遷移[23]。除了炎癥和氧化應激反應，脂質浸潤、血管平滑肌細胞激活、免疫反應等均參與動脈粥樣硬化的發生和發展。由此可見，紅花主要通過調節炎癥、氧化應激及免疫反應等治療動脈粥樣硬化。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學研究方法探討紅花治療動脈粥樣硬化的活性成分、靶點及作用機制，通過構建相關網絡圖直觀地發現紅花治療動脈粥樣硬化具有多成分-多靶點-多途徑的特點，與中醫藥治療疾病的特點相吻合，相較于西藥單一作用，其優勢更佳明顯。