電項針干預(yù)對急性腦出血大鼠Nrf2、NQO1表達和神經(jīng)功能的影響?

張曉輝 沈詩彥 柳依江 邵文娜 崔 海△

（1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069；2.浙江省杭州市杭州種福堂中醫(yī)醫(yī)院，浙江 杭州 310011；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 250000）

急性腦出血（ICH）屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇，占所有中風(fēng)病的10%～15%，發(fā)病率和死亡率較高，存活率隨著發(fā)病時間延長逐漸降低且存活者往往有重度殘疾，給家庭和社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)［1-2］。對于腦出血繼發(fā)性腦損傷的病理機制，目前研究主要集中在腦出血后血腦屏障破壞、腦水腫、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等方面［3］。腦出血后，體內(nèi)積聚的自由基增多和清除自由基的能力下降使其氧化與抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡，造成了氧化應(yīng)激損傷。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）通路是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要通路［4］，可上調(diào)NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）和血紅素加氧酶-1（HO-1）等抗氧化酶的表達，抑制氧化反應(yīng)，達到神經(jīng)保護作用［5］。本實驗通過觀察腦出血急性期大鼠腦組織中Nrf2、NQO1的表達情況來探討電項針干預(yù)對腦出血繼發(fā)性腦損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2016-0011，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，光照/黑暗周期為12 h/12 h，自由飲水、進食。

1.2 試劑與儀器

qPCR試劑盒（美國KAPA Biosystems），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。BCA Protein As?say Kit（北京Cwbiotech公司），蛋白裂解液（中國優(yōu)科卓業(yè)生物公司），Protein ladder（北京Biomed公司），SDS（美國Sigma公司），APS（美國Amresco公司），TRIZOL（美國Invitrogen公司），HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（康為世紀(jì)，批號CW2582），HiFiScript cDNA Syn?thesis Kit（康為世紀(jì)，批號CW2569），兔抗Nrf2抗體（美國abcam公司，批號ab31163），兔抗NQO1抗體（美國abcam公司，批號ab34173），桌面數(shù)顯腦立體定位儀（深圳RWD Life Science），華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），高速冷凍離心機（Beckman公司），實時定量PCR儀（美國ABI）。

1.3 分組與造模

1）分組：實驗動物隨機分成4組，空白對照組、假手術(shù)組、ICH模型組和ICH電項針組，每組6只。2）模型制備：空白對照組不給予任何干預(yù)。采用自體血注入尾狀核形成血腫，制備自體血腦出血模型［6］。大鼠稱重后給予7 mL/kg 20%烏拉坦腹腔注射麻醉，頭部備皮，將大鼠頭部以俯臥位體位固定在腦立體定位儀上，消毒后沿正中線切開約1 cm，充分暴露前囟，根據(jù)大鼠腦定位圖譜［7］確定右側(cè)尾狀核位置，在前囟右3 mm、后0.2 mm處用牙科鉆鉆開直徑約1 mm的小孔，深度至硬腦膜但不傷及腦實質(zhì)。尾靜脈抽取約100 μL自體血備用，用微量注射器抽取50 μL自體血沿小孔勻速注入，深度約5.5 mm，速度為5 μL/min，注射完畢后原位留針10 min，緩慢退針，隨即用骨蠟封閉，縫合頭部皮膚并消毒。假手術(shù)組除不注入自體血外，其余操作同模型組。造模1 d后，行平衡木行走試驗［8］對大鼠神經(jīng)功能進行評分，評分大于1分可認(rèn)為造模成功，予以納入實驗，否則剔除。

1.4 干預(yù)方法

ICH電項針組大鼠造模后第1天進行干預(yù)，根據(jù)《實驗針灸學(xué)》［9］和《大鼠穴位圖譜的研制》［10］確定供血（頸4夾脊穴）和風(fēng)池位置。常規(guī)消毒后，選用0.35 mm×40 mm華佗牌不銹鋼毫針針刺，進針深度約3 mm，連接華佗牌電子針療儀，正極接風(fēng)池，負(fù)極接供血，設(shè)置疏波，頻率1 Hz，針刺時間15 min/次，每日1次，連續(xù)5 d。其他組均不干預(yù)。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 平衡木行走試驗 造模1、3、5 d后采用平衡木行走試驗對大鼠行為學(xué)進行評價［11］，選用長80 cm、寬2.5 cm的橫木條作為測試裝置。評分標(biāo)準(zhǔn)為6個等級。0分：能跳上平衡木，在上面行走不會跌倒；1分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會小于50%；2分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會大于50%；3分：在健側(cè)后肢幫助下能跳上平衡木，但受累癱瘓側(cè)后肢不能幫助向前移動；4分：在平衡木上不能行走，但可坐在上面；5分：將大鼠放在平衡木上會掉下來。

1.5.2 腦組織Nrf2、NQO1 mRNA測定 造模后第5日給予麻醉并斷頭取腦，保存于-80℃。選擇血腫周圍組織，取100 mg使用試劑盒提取樣本總RNA。設(shè)計和合成引物見表1，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA根據(jù)HiFiScript cD?NA第一鏈合成試劑盒（CW2582）的操作說明書，進行實時PCR反應(yīng)，采用2-ΔΔCt值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

表1 目的基因引物序列

1.5.3 腦組織Nrf2、NQO1蛋白表達水平檢測 按照RIPA試劑盒提取腦組織總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，將每孔30 μg蛋白樣品上樣量進行點樣，10%SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加入適量一抗4℃孵育過夜，TBST清洗后，加入適量二抗室溫孵育40 min。滴加ECL顯色液顯色，根據(jù)發(fā)光程度調(diào)整不同壓片時間進行曝光拍片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠平衡木行走試驗評分比較

見表2。造模1 d后，假手術(shù)組與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其余各組與假手術(shù)組相比評分均明顯升高（P<0.01）。造模3、5 d后，與ICH模型組相比，ICH電項針組評分有下降趨勢（P<0.01）。

表2 各組大鼠平衡木行走試驗評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠平衡木行走試驗評分比較（分，±s）

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與假手術(shù)組比較，?P<0.05，??P<0.01；與ICH模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

組別空白對照組假手術(shù)組ICH模型組ICH電項針組n 6 6 6 6造模1 d后0.00 0.17±0.40 1.50±0.49##**1.17±0.40△△造模3 d后0.00 0.33±0.47 2.67±0.75##*1.33±0.47△△造模5 d后0.00 0.17±0.37 2.00±0.58##**0.67±0.47△△

2.2 各組大鼠腦組織Nrf2、NQO1 mRNA含量比較

見表3。與空白對照組相比，ICH模型組和ICH電項針組Nrf2、NQO1 mRNA表達量均有所上升（P<0.01）。ICH模型組與假手術(shù)組相比，Nrf2、NQO1mRNA表達量明顯上升（P<0.01）。與ICH模型組相比，ICH電項針組的表達量升高（P<0.01或P<0.05）。

表3 各組大鼠腦組織Nrf2、NQO1 mRNA含量比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織Nrf2、NQO1 mRNA含量比較（±s）

組別空白對照組假手術(shù)組ICH模型組ICH電項針組n 6 6 6 6 Nrf2 mRNA 0.56±0.14 0.68±0.09 1.76±0.17##**2.42±0.32△△NQO1 mRNA 0.43±0.11 0.60±0.08 1.84±0.25##**2.21±0.25△

2.3 各組大鼠腦組織Nrf2、NQO1蛋白表達水平比較

見表4，圖1。與空白對照組相比，其余各組腦組織中Nrf2、NQO1蛋白表達量均上升（P<0.05或P<0.01）；與假手術(shù)組相比，ICH模型組蛋白表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與ICH模型組相比，ICH電項針組蛋白表達明顯升高（P<0.05或P<0.01）。

表4 各組大鼠腦組織Nrf2、NQO1蛋白表達水平比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織Nrf2、NQO1蛋白表達水平比較（±s）

組別空白對照組假手術(shù)組ICH模型組ICH電項針組n 6 6 6 6 Nrf2蛋白0.22±0.06 0.27±0.06##0.36±0.07##**0.45±0.07△△NQO1蛋白0.15±0.10 0.22±0.06#0.29±0.13##**0.35±0.11△

圖1 各組大鼠腦組織Nrf2、NQO1蛋白表達水平

3 討論

中風(fēng)病的基本病機是機體陰陽失調(diào)，氣血逆亂，上犯于腦，導(dǎo)致腦脈痹阻或血溢腦脈之外，使神明失養(yǎng)，其病性是本虛標(biāo)實［12］。臨床表現(xiàn)以突然昏仆、不省人事、半身不遂、言語障礙為主要特征。

電項針是由高維濱教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)立的［13］，以風(fēng)池、供血為主穴，其治療機制一是興奮腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)，活化大腦皮質(zhì)神經(jīng)元；二是促進椎-基底動脈系統(tǒng)血液循環(huán)，改善腦部血液循環(huán)、腦脊液循環(huán)來治療腦頸項部疾病。本實驗采用的供血、風(fēng)池二穴，從解剖角度講，淺層有枕動脈、枕靜脈，深層有椎動脈，針刺項部腧穴并施加疏波脈沖電流刺激能夠改善椎-基底動脈、頸內(nèi)動脈血液、Willis環(huán)的血液循環(huán)，同時能夠產(chǎn)生神經(jīng)沖動，刺激中樞神經(jīng)使受損的神經(jīng)反射重新建立，進而達到改善ICH后大腦、小腦、腦干的各項功能。從中醫(yī)理論講，風(fēng)池穴屬足少陽膽經(jīng)，是膽經(jīng)與陽維脈交會之處，有清肝利膽、平肝潛陽之效；供血位于風(fēng)池下1.5寸，平頸2、3椎間，有補血活血之效，廣泛用于治療腦缺血發(fā)作（椎-基底動脈系統(tǒng)）、吞咽困難、肌緊張性頭痛、失眠、功能性震顫等癥［14］，故針刺二穴可平肝熄風(fēng)，醒腦開竅，促進血液循環(huán)和腦功能恢復(fù)。我們及同道研究均表明電項針能顯著降低ICH大鼠腦組織AQP4蛋白和mRNA表達［15］，降低急性期腦組織精氨酸加壓素的表達［16］，抑制腦水腫發(fā)生，減輕神經(jīng)損傷。通過采用神經(jīng)行為認(rèn)知狀態(tài)檢查量表，比較治療前后的定向能力、語言能力、記憶能力、計算能力評分及總分，說明電項針能減少ICH后神經(jīng)功能損傷，改善患者認(rèn)知功能障礙和運動功能缺損［17］，以上均說明電項針治療ICH疾病臨床療效明確。

Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用是通過與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合［18］，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。劉小江等［19］研究表明抑制MiR-27b的表達，激活Nrf2/ARE信號通路及下游靶蛋白HO-1、NQO1表達，可有效緩解高血壓性ICH模型大鼠體內(nèi)的氧化損傷和神經(jīng)炎癥，降低了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。張莉等［20］研究表明，抑制Fyn后Nrf2的蛋白表達明顯升高，其下游因子HO-1和NQO1的表達也顯著升高。本實驗中，與假手術(shù)組相比，各組Nrf2、NQO1的表達均增高且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，電項針干預(yù)后Nrf2、NQO1 mRNA和蛋白的表達較模型組增高，說明電項針能夠促進出血后Nrf2、NQO1的表達。通過比較平衡木行走試驗評分，說明電項針干預(yù)對神經(jīng)功能有改善作用。

綜上，本實驗表明電項針可以提高Nrf2、NQO1基因和蛋白的表達，調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕腦出血后繼發(fā)性損傷，進而改善神經(jīng)功能損傷，其機制可能是通過激活Nrf2信號通路來實現(xiàn)的，但具體機制還需進一步探究。