芪蛭膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷相關因子p-Akt、Cathepsin表達的影響?

莊曉彤 段芳芳 鞠麗麗 孫曉偉 陸雪健 蔣希成△

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

缺血性腦卒中是一種由于大動脈或其分支血管阻塞導致血流不能流入大腦而引起腦組織急性損傷的腦血管類疾病［1］，是臨床較為常見的、多發的重大疾病，具有高發病率、高死亡率、高致殘率等特點。目前，臨床治療主要通過藥物溶栓或介入等手段快速恢復大腦缺血缺氧狀態。腦組織缺血后重獲血流灌注或氧供應后，對腦組織產生的損傷作用是雙向的，它既可挽救瀕臨死亡的細胞，又可加重細胞的損傷甚至死亡［2］，對此臨床上缺乏有效的診療手段。近年來，中醫藥對腦缺血再灌注損傷（CIRI）的診療突顯了越來越重要的優勢，且隨著細胞凋亡、自噬的發現，其在腦缺血再灌注損傷過程中的作用得到醫療科研工作者的高度重視。本實驗通過對PI3K-Akt-mTOR信號通路相關因子p-Akt、Cathepsin B、Cathepsin D表達研究，進一步觀察芪蛭膠囊對腦缺血再灌注大鼠神經功能的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質量（200±20）g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001。大鼠在實驗室飼養適應1周，溫度為（22±1）℃，濕度45%～55%，自由進食進水，12 h晝夜節律。動物實驗操作參考《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 藥物

芪蛭膠囊中藥復方（院內制劑）：黃芪（批號170301）、丹參（批號180601）、燙水蛭（批號151003）、地龍（批號160101）、石菖蒲（批號180501）、郁金（批號180802）、川芎（批號180601）、當歸（批號180102）、炙甘草（批號171001），生產廠家為黑龍江德順長中藥飲片有限公司。將藥物煎煮后以旋轉蒸發儀濃縮，根據人和大鼠體表面積折算藥物使用量，煎煮濃縮為相當于生藥1.27 g/mL的藥液，4℃冰箱密封、保存。

1.3 試劑與儀器

自噬抑制劑3-MA（阿拉丁，批號M129496），LY294002（MedChemExpress（MCE，批號 HY-10108），PBS（雙螺旋，批號P10033），TritonX-100（Beyotime，批號ST795），山羊血清（Solarbio，批號SL038），DAPI（Sig?ma，批號C1002），抗熒光淬滅劑（Solarbio，批號C0296-3），Western blotting及IP細胞裂解液（Beyotime，批號P0013），PMSF（Beyotime，批號ST506），細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（Beyotime，批號P0033），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，批號P0011），30%Acr-Bis（29∶1）（Beyotime，批號 ST003），SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（Beyotime，批號P0015），ECL發光液（Be?yotime，批號P0018），預染蛋白分子量標準（Fermentas，批號 26616），PVDF膜（Millipore，批號 IPVH00010），BSA（Biosharp，批號BS043），脫脂奶粉（伊利，批號：Q/NYLB 0039S），p-AKT（CST，批號 4060），Cathepsin B（Proteintech，批號12216-1-AP），Cathepsin D（Protein?tech，批號21327-1-AP），山羊抗兔IgG（beyotime，批號A0208），內參抗體β-actin（Santa cruz，批號sc-47778）。腦立體定位儀（上海奧爾科特生物科技有限公司），臺式牙鉆機（上海齒科醫械廠），微量注射器（鎮江康利醫療器械有限公司），電熱恒溫培養箱（天津泰斯特儀器有限公司），酶標儀（美國BIOTEK），轉移槽（北京六一生物科技有限公司），雙垂直蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司），凝膠成像系統（北京六一生物科技有限公司），超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.4 分組與給藥

給予常規飼料、雙蒸水適應性飼養7 d后觀察各組大鼠的狀態，剔除狀態不佳的大鼠，并及時補充新鼠。按隨機數字表法將60只大鼠分為假手術組、模型組、3-MA組、LY組、中藥組，每組12只。中藥組每日給予芪蛭膠囊2.5 mL藥液灌胃，其余各組給予等量生理鹽水灌胃。每日1次，連續7 d。3-MA組于造模前24 h側腦室注射3-MA溶液10 μL（3 μg/μL），LY組造模前30 min腹腔注射LY294002溶液10 mg/kg，取材前2.5 h再注射1次。

1.5 模型制備

各組大鼠灌胃7 d，第8日參照改良Zea Longa法［3］，制備大鼠大腦中動脈阻塞模型（MCAO）。術前大鼠禁食24 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）麻醉，仰臥位固定于手術臺上。用鑷子撐開大鼠的嘴，夾出舌頭，開放氣道。備皮消毒后于大鼠頸部正中線偏右處做一2.0～2.5 cm的縱向切口，鈍性分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），分離時應注意保護沿血管的神經。在近心端結扎CCA、ECA，用動脈夾暫時夾閉CCA遠心端，然后在CCA近心端距分叉部4 mm處用眼科剪剪一小口，將帶有石蠟頭的線栓插入到CCA，系牢線栓，用鑷子輕推栓線至分叉處，松開動脈夾，使線栓從血管分叉處進入ICA，至線栓中部標記點到達分叉位置附近，插入長度約為（18±2）mm，于CCA遠心端用細線結扎。剪斷結扎在CCA、ECA的多余線頭，消毒后縫合切開皮膚。術后2 h進行再灌注，將栓線拔出約1 cm左右，以防出血。術后大鼠飼養于SPF級動物實驗室24 h，自由進食飲水。假手術組僅將CCA、ECA、ICA游離，不插入線栓，其余步驟同其他組。在手術期間及術后，采用保溫措施將大鼠體溫維持在（37.0±0.5）℃。

1.6 神經功能評分

各組大鼠CIRI 24 h后，采用神經功能評分（NSS）量表評估功能神經受損程度，以確定大鼠MCAO后的運動、感覺、平衡和反射障礙等［4］。NSS評分共18分，分值越高，神經功能缺損程度越重。神經損傷評分分級如下：嚴重損傷（13～18分），中度損傷（7～12分），輕度損傷（1～6分），無損傷（評分為0）。

1.7 標本采集與檢測

1.7.1 腦組織含水量測定 各組大鼠完成神經功能評分后，每組取5只大鼠，快速斷頭取腦，去除小腦和腦干。用電子天平稱取標本的濕重，然后將腦組織置入電熱恒溫培養箱（100±2）℃中烘24 h至恒重，稱取干重。采用干、濕比重法計算腦組織含水量，腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.7.2 Western blotting法檢測大腦組織中p-Akt、Ca?thepsin B、Cathepsin D表達水平 各組取7只大鼠再灌注24 h，斷頭取腦，缺血區腦組織冷凍后研磨，加適當量的裂解液，冰上靜置30 min，4℃低溫冷凍離心機10 000 r/min離心5 min，取上層清液（大腦組織總蛋白樣品）。應用BCA法蛋白定量，酶標儀讀數并記錄。以RIPA調整蛋白濃度，根據目的蛋白分子量配制15%分離膠，濃縮膠濃度為5%，上樣，SDS-PAGE電泳，5%TBST中室溫，一抗（兔抗AKT抗體1∶500）4℃孵育過夜，二抗［山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10000］，搖床搖動5 min。轉膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經脫脂奶液封閉、TBST洗膜后，加入Akt二抗（1∶1000）。用ECL化學發光試劑檢測蛋白表達水平，用凝膠圖像處理系統（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。以β-actin為內對照標準化后，比較其表達量的變化。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠NSS評分比較

見表1。假手術組大鼠沒有表現出神經功能受損。其余各組在CIRI 24 h均出現不同程度的神經功能缺損，與假手術組比較均有顯著差異（P<0.05），中藥組與模型組比較神經功能評分降低（P<0.05）。提示芪蛭膠囊可減輕CIRI大鼠的神經損傷。

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較

見表1。假手術組大鼠無腦水腫表現。CIRI 24 h后，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高（P<0.05）；與模型組、3-MA組、LY組比較，中藥組腦組織含水量明顯降低（P<0.05）。提示芪蛭膠囊可降低CIRI大鼠的腦組織含水量。

表1 各組大鼠NSS評分及腦組織含水量比較（±s）

表1 各組大鼠NSS評分及腦組織含水量比較（±s）

注：與假手術組比較，?P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與中藥組比較，△P<0.05。下同。

組別假手術組模型組3-MA組LY組中藥組n 12 12 12 12 12 NSS評分（分）0.00±0.00 11.83±0.68*#14.15±0.32*#△12.26±0.17*#△9.92±0.08*#n55555腦含水量（%）78.18±0.10 82.81±1.05*△83.55±1.17*△83.18±0.86*△81.53±2.01*#

2.3 各組大鼠腦組織相關因子p-Akt、Cathepsin蛋白表達比較

CIRI 24 h，與假手術組相比，其他各組p-Akt蛋白表達均減少（P<0.05），與模型組相比，3-MA組、LY組、中藥組中p-Akt蛋白表達減少（P<0.05），但與3-MA組、LY組相比，中藥組中p-Akt蛋白表達有所增加（P<0.05）。CIRI 24 h，與假手術組相比，其他各組Ca?thepsin B蛋白表達均增加（P<0.05），與模型組相比，中藥組中Cathepsin B蛋白表達顯著增加（P<0.05）。CIRI 24 h，與假手術組相比，其他各組Cathepsin D蛋白表達均增加（P<0.05），與模型組相比，中藥組Ca?thepsin D蛋白表達顯著增加（P<0.05）。結果見圖1～圖3，表2。提示芪蛭膠囊可降低p-Akt蛋白的表達，增加Cathepsin B、Cathepsin D蛋白的表達，進一步激活自噬。

圖1 各組大鼠腦組織p-Akt蛋白表達

圖2 各組大鼠腦組織Cathepsin B蛋白表達

圖3 各組大鼠腦組織Cathepsin D蛋白表達

表2 各組大鼠腦組織p-Akt、Cathepsin蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織p-Akt、Cathepsin蛋白表達比較（±s）

組別假手術組模型組3-MA組LY組中藥組n 7 7 7 7 7 p-Akt 1.00±0.00 0.48±0.02*0.30±0.01*#△0.20±0.04*#△0.44±0.01*#Cathepsin B 1.00±0.00 2.90±0.01*2.65±0.03*#△4.10±0.02*#△4.16±0.05*#Cathepsin D 1.00±0.00 3.27±0.02*2.01±0.04*#△4.21±0.03*#△4.29±0.06*#

3 討 論

張仲景于《金匱要略》首載中風之名，其曰“脈微而數，中風使然”，認為正虛邪中為中風病因；清代醫家王清任提出“氣虛致瘀”之論點，并創立益氣活血的經典名方——補陽還五湯；張錫純亦言“氣血虛者，其經絡多瘀滯……以化其瘀滯，則偏枯痿廢者，自愈也”。古今醫家對于中風病因病機的認識已基本趨于一致，認為是本虛標實，氣虛為本，血瘀為標，瘀血既成，又影響氣的生血及行血，使腦絡瘀阻加重，易發為中風，治療多以益氣活血為治療大法。筆者課題組在總結前人經驗的基礎上，又依據現代人高脂肪、高熱量飲食的生活習慣，易致脾虛而生痰，認為缺血性腦中風的主要病機為氣虛血瘀夾痰，氣虛為本，血瘀痰濁為標；氣虛無力運血則發為血瘀，而瘀血阻礙氣機，水液代謝失常，氣滯濕阻，聚濕為痰；痰瘀既為病理產物又為致病因素，痰瘀互結阻滯人體氣血運行，壅塞腦竅，發為中風。基于此提出益氣活血、祛瘀通絡化痰的治療大法，擬定芪蛭膠囊中藥復方治療缺血性中風，并在臨床應用中取得了顯著療效。方中重用黃芪為君，大補元氣，氣足則血生，氣旺促血行；臣以蟲類水蛭、地龍之品，破血逐瘀、通經活絡，石菖蒲、郁金化痰祛瘀，開竅醒神；佐以丹參、當歸、川芎共奏補血、活血之功，使以炙甘草調和諸藥。諸藥合用，共奏攻補兼施、扶正祛邪之功。本課題組在前期實驗研究發現［5-7］，芪蛭膠囊對大鼠局灶性腦缺血具有保護作用，能保護腦組織神經元內線粒體功能，抑制PKC-MARCKS信號通路的激活及小膠質細胞的生成，進而減輕CIRI損傷。

近年來，自噬作為新發現的程序性細胞死亡方式［8］，在腦缺血再灌注中的參與作用逐漸得到重視。有研究表明，CIRI的整個過程中均有自噬的參與，且腦缺血再灌注后自噬激活就像一把雙刃劍［9］，適度激活可對細胞損傷起保護作用，過度的自噬可誘導自噬性細胞死亡。CIRI后，多種信號通路參與了調控自噬過程，其中PI3K-Akt-mTOR信號通路在自噬的調控中扮演了核心角色［10］。自噬的整個過程是由自噬相關基因家族調控，組織蛋白酶（cathepsins）、Akt蛋白等扮演著重要角色。絲蘇氨酸蛋白激酶（Akt）是PI3K的下游效應物，能介導多種生物學效應，I型PI3K催化生成PIP3，進而通過誘導AKT活化而抑制自噬［11］。本實驗結果表明，中藥組神經功能評分明顯降低（P<0.05），腦組織含水量降低（P<0.05）；Western blotting結果顯示，模型組大鼠p-Akt表達較假手術組降低，自噬激活，中藥組p-Akt表達進一步降低，表明自噬被進一步激活，證實了中藥芪蛭膠囊通過激活自噬而減輕了缺血缺氧的腦組織損傷。

Cathepsin是一種廣泛存在的嗜酸性溶酶體蛋白水解酶，在神經細胞內以酶原的形式貯存在溶酶體中。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬體內膜及其包裹的物質進入溶酶體腔，被溶酶體中的酶水解［12］。Cathepsin作為溶酶體的標志物，通過選擇性水解靶蛋白肽鍵而參與自噬進程［13］。在大鼠缺血性卒中后6 h即可檢測到Cathepsin的表達，同時伴隨LC3-Ⅱ的表達上調，可以顯著減少大鼠腦梗死面積［14］。Cathepsin D是是溶酶體最主要的蛋白水解酶之一，可降解自噬溶酶體以維持細胞的穩態［15］。Cathepsin D可激活Cathepsin B、H、L的酶原形式［16］。Felbor等［17］報道Cathepsin B和Cathepsin L在維持中樞神經系統正常功能方面起重要作用。薛杭［18］研究發現缺血缺氧后24 h，新生大鼠左側海馬區溶酶體蛋白酶Cathepsin B表達增高。本實驗結果顯示，模型組大鼠Cathepsin D、Cathepsin B表達水平明顯高于假手術組，提示自噬小體促進了溶酶體活化，完成自噬溶酶體降解的過程，中藥組Cathepsin D、Cathepsin B表達量較模型組進一步增加，結合p-Akt蛋白中藥組表達結果，認為自噬小體增加使蛋白水解酶表達增加，自噬進一步活化，從而有效保護缺血缺氧的腦組織細胞。

綜上所述，本實驗通過對大鼠腦缺血再灌注損傷相關因子p-Akt、Cathepsin D、Cathepsin B表達研究，闡明了芪蛭膠囊可進一步激活自噬而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的分子機制，對大鼠腦缺血再灌注損傷起到神經保護作用。