腦膠質(zhì)瘤患者異檸檬酸脫氫酶（IDH）1/2基因突變與O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性研究

林華亮 鄭澤洲 鄭偉杰

1.廣東省汕頭市龍湖區(qū)第二人民醫(yī)院急診外科，廣東汕頭 515041；2.廣東省汕頭市中心醫(yī)院神經(jīng)外二科，廣東汕頭515100；3.廣東省汕頭潮南民生醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東汕頭 515144

腦膠質(zhì)瘤屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，但是WHO規(guī)定，Ⅰ級(jí)腦膠質(zhì)瘤通過(guò)手術(shù)完全切除治愈，絕大部分Ⅱ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤會(huì)經(jīng)常性復(fù)發(fā)，增加了患者的生活壓力[1-2]。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，很多疾病的治愈效率明顯提高，但是對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的研究表明[3-4]，其生存時(shí)間沒(méi)有得到根本性改善。隨著腦膠質(zhì)瘤WHO經(jīng)典組織學(xué)分級(jí)方案的制訂，越來(lái)越多的研究表明分子遺傳學(xué)的分類方案和患者預(yù)后有著密切的關(guān)系[5-6]。目前最新的膠質(zhì)瘤分類，將經(jīng)典組織學(xué)分級(jí)和分子遺傳學(xué)的分類進(jìn)行結(jié)合，從而對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行綜合性的研判。有研究表明[7-8]，2008年，異檸檬酸脫氫酶（IDH）1/2基因在膠質(zhì)瘤患者全基因組測(cè)序中被發(fā)現(xiàn)，其和腦膠質(zhì)瘤有著密切的關(guān)系，同時(shí)IDH 1/2突變和患者的生存時(shí)間也有一定的關(guān)聯(lián)性。本研究通過(guò)分析汕頭市龍湖區(qū)第二人民醫(yī)院普外科2018年1月至2020年2月腦膠質(zhì)瘤患者60例臨床資料進(jìn)行分析，擬探討腦膠質(zhì)瘤患者IDH1/2基因突變與O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取汕頭市龍湖區(qū)第二人民醫(yī)院普外科2018年1月至2020年2月腦膠質(zhì)瘤患者60例臨床資料進(jìn)行分析，其中男40例，女20例，年齡4～77歲，平均（40.3±15.2）歲。按照中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織學(xué)分類，Ⅰ級(jí)3例，毛細(xì)胞型星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤3例，Ⅱ級(jí)12例，少突星形細(xì)胞瘤3例、彌漫星形細(xì)胞瘤4例、星形細(xì)胞瘤1例、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例，Ⅲ級(jí)15例，間變星形細(xì)胞瘤9例、間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤6例，Ⅳ級(jí)30例，膠質(zhì)肉瘤5例、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者生存質(zhì)量評(píng)分＞60分；②通過(guò)手術(shù)和組織病理學(xué)證實(shí)結(jié)果為惡性腦膠質(zhì)瘤；③患者血紅蛋白≥100 g/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟、肝、肺和腎臟重要臟器功能異常患者；②身體和其他臟器腫瘤患者；③接受放化療或免疫性治療患者；④嚴(yán)重性過(guò)敏患者。

1.2 方法

1.2.1 IDH 1/2基因突變的檢測(cè)方法 對(duì)IDH 1/2基因突變進(jìn)行測(cè)序。首先通過(guò)患者腫瘤標(biāo)本組織進(jìn)行DNA提取，采用紫外分光光度計(jì)（SHIMADZU/島津）觀察DNA是否符合要求，對(duì)合格的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳法觀察擴(kuò)增基因。去除擴(kuò)增產(chǎn)物中的雜質(zhì)，如脫氧核糖核苷三磷酸、引物二聚體、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等，然后在將PCR產(chǎn)物作為模板，以脫氧核糖核苷三磷酸和雙脫氧核苷三磷酸作為底物進(jìn)行熒光標(biāo)記，完成線性擴(kuò)增，形成了僅差1個(gè)堿基對(duì)的部分片段混合物，通過(guò)去除雜志，純化PCR產(chǎn)物，高溫讓雙鏈DNA變性，采用毛細(xì)管電泳，觀察結(jié)果，進(jìn)行待測(cè)模板序列的判讀。

1.2.2 MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的檢測(cè) 通過(guò)甲基化特異性PCR（MSP）法進(jìn)行檢測(cè)，首先將腫瘤標(biāo)本組織進(jìn)行DNA提取，采用紫外分光光度計(jì)觀察DNA是否符合要求，通過(guò)亞硫酸鹽對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾，PCR擴(kuò)增特異性引物，凝膠電泳檢測(cè)MSP的產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①觀察腦膠質(zhì)瘤患者IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況。甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)[9-10]：甲基化的特異性引物出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，但是非甲基化引物沒(méi)有擴(kuò)增條帶，兩種特異性引物均有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。②觀察IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化相關(guān)性分析情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)，針對(duì)計(jì)數(shù)資料通過(guò)百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析通過(guò)Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤患者IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

18例檢測(cè)出IDH 1/2基因突變，其中WHO的分級(jí)Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)7例，Ⅳ級(jí)3例，分級(jí)在IDH 1/2基因突變分布中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=108.454，P=0.000），33例檢測(cè)出MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，其中WHO的分級(jí)Ⅰ級(jí)2例、Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)8例，Ⅳ級(jí)15例，分級(jí)在MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分布中，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.527，P=0.538）。見(jiàn)表1。

2.2 IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化相關(guān)性分析情況

IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化呈明顯正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.368，P=0.014）。

3 討論

IDH 1/2基因處于人體染色體2q33，3上的IDH 1/2基因基因編碼，屬于三羧酸循環(huán)限速酶的一種，參與細(xì)胞能量代謝[11-12]。有資料顯示[13-14]，組織學(xué)分級(jí)相同的腦膠質(zhì)瘤患者，IDH 1/2基因突變型高于野生型的預(yù)后，說(shuō)明IDH 1/2基因突變和腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)有一定的關(guān)系。本研究中，18例檢測(cè)出IDH 1/2基因突變，其中WHO的分級(jí)Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)7例，Ⅳ級(jí)3例，分級(jí)在IDH 1/2基因突變分布中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要將形態(tài)組織學(xué)和基因分型密切的結(jié)合，才可以更加準(zhǔn)確判定腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后水平[15-16]。MGMT屬于DNA修復(fù)蛋白的一種，對(duì)其編碼的基因處于染色體10q26。有資料顯示，放療聯(lián)合化療的患者，MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的生存率較高，同時(shí)MGMT甲基化在烷化劑化療中更加敏感，在腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后判定中具有重要的意義[17-18]。本研究中，33例檢測(cè)出MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，其中WHO的分級(jí)Ⅰ級(jí)2例、Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)8例，Ⅳ級(jí)15例，分級(jí)在MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分布中，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果和國(guó)外研究結(jié)果基本一致[19-20]。IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化呈現(xiàn)明顯正相關(guān)，提示可能因IDH 1/2基因突變型的腦膠質(zhì)瘤中，2-羥基戊二酸蓄積有密切的關(guān)系，同時(shí)，2-羥基戊二酸積累對(duì)于調(diào)節(jié)DNA甲基化酶形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制，造成患者CpG島甲基化表型進(jìn)展，進(jìn)而誘導(dǎo)MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化。此結(jié)果也印證了有關(guān)學(xué)者研究中，MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化和轉(zhuǎn)錄沉默，增加了遺傳的不穩(wěn)定性，也就是促進(jìn)出現(xiàn)了G和A轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而造成IDH1/2 的132位上的基因突變。此結(jié)果和Turcan等[21]研究中，靶向的DNA甲基化可以將IDH1/2基因突變的甲基化逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而對(duì)腦膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的分化形成阻斷，有利于控制腫瘤進(jìn)展，為指導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤治療提供依據(jù)。

表1 腦膠質(zhì)瘤患者IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤患者IDH1/2基因突變與MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化呈正相關(guān)，為指導(dǎo)臨床診斷治療，提供了理論依據(jù)。