博來霉素誘導建立硬皮病模型小鼠的腸道受累情況分析研究▲

周雪艷 呂軍影

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧市 530021

硬皮病又稱系統(tǒng)性硬化癥，是一種以皮膚及各系統(tǒng)(特別是肺、心臟、腸道、骨骼肌和肌腱)膠原纖維硬化為特征的結締組織疾病。硬皮病發(fā)病機制復雜，患者常伴有多器官損害，5年生存率為50%，目前被認為是不治之癥，是所有風濕病中病亡率最高的疾病[1]。腸道是硬皮病患者最常累及的器官，約90%的硬皮病患者出現(xiàn)腸道癥狀[2-4]。硬皮病患者腸道并發(fā)癥主要表現(xiàn)為食管運動障礙、胃癱、小腸細菌過度生長、結腸運動障礙和大便失禁等，嚴重影響患者的生活質量，給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟壓力和心理負擔。為探討硬皮病的發(fā)病機制、病理生理過程和治療手段等，學界就硬皮病進行了較多的基礎實驗研究和探索，但建立的硬皮病動物模型大多是模擬硬皮病的皮膚和肺部癥狀，而硬皮病腸道并發(fā)癥動物建模的研究鮮有報道。為更好地研究硬皮病及其腸道并發(fā)癥，構建一種與臨床吻合度高且便捷、穩(wěn)定、可復制的硬皮病腸道并發(fā)癥動物模型，本研究采用博來霉素誘導雌性BALB/c小鼠建立了硬皮病小鼠模型，并探討了小鼠腸道并發(fā)癥的病理特征，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性BALB/c小鼠20只，SPF級，6～8周齡，體重18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。將小鼠飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，讓小鼠生活于安靜、恒溫、恒濕的環(huán)境中，自由飲水進食。實驗方案及操作經(jīng)廣西醫(yī)科大學動物實驗委員會審查批準，符合實驗動物倫理學要求。

1.1.2 主要實驗試劑 注射用博來霉素磷酸鹽緩沖液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：H20055883)； HE染色和Masson染色試劑(來自廣西醫(yī)科大學免疫組化實驗室)；OLYMPUS正置四色熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號BX53)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將20只雌性BALB/c小鼠隨機分為對照組和模型組，每組10只，用電動剃毛器剃除小鼠背部中央?yún)^(qū)相同部位面積約2 cm×2 cm的被毛。在對照組小鼠背部脫毛區(qū)皮下注射磷酸鹽緩沖液(PBS)0.1 mL，1次/d；在模型組小鼠背部脫毛區(qū)皮下注射博來霉素磷酸鹽緩沖液(500 μg/mL)0.1 mL，1次/d。兩組小鼠均連續(xù)皮下注射4周[5]。注射結束后第2天開始,兩組小鼠禁食不禁水24 h，之后給予每只小鼠半固體營養(yǎng)糊(黑芝麻糊與碳素墨水加水攪拌均勻，配成約75 g的黑色糊狀物75 mL)0.5 mL灌胃，灌胃后20 min后脫頸處死小鼠。

1.2.2 模型處理和分析 (1)剪開兩組脫頸處死小鼠腹腔，用細線分別在胃賁門和幽門處結扎，迅速分離胃賁門處至回腸末端胃腸。輕輕剝離腸系膜后，輕輕將胃腸鋪直于實驗臺上，避免用力拉扯，用尺子測量幽門到黑色半固體糊前沿的距離和幽門至回盲部的小腸全長。(2)取兩組脫頸處死小鼠背部注射部位的皮膚、肺組織、結腸組織，放入10%多聚甲醛溶液中固定，脫水、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進行HE染色和Masson染色。

1.3 觀察指標

1.3.1 小鼠一般情況 造模第4周開始，觀察比較兩組小鼠的活動度、皮膚、毛發(fā)、體重、糞便等一般情況。

1.3.2 小腸推進率 小腸推進率=幽門至黑色半固體糊前沿的距離/幽門至回盲部全長的距離×100%。

1.3.3 組織病理學觀察 光學顯微鏡下觀察兩組小鼠背部注射部位皮膚、肺組織、結腸組織切片的結構、炎性浸潤情況、纖維化情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組小鼠的一般情況比較 模型建立過程中無小鼠死亡。造模第4周，對照組小鼠精神良好，反應靈敏，進食和飲水量正常，未見消瘦，背部注射區(qū)皮膚無硬化，毛發(fā)柔軟且有光澤，生長迅速，大便形狀正常、量適中；模型組小鼠精神差，喜靜懶動，厭食消瘦，背部注射區(qū)皮膚增厚變硬、彈性差且與皮下組織粘連，毛發(fā)未見生長，大便干結、量偏少。

2.2 兩組小鼠的皮膚組織病理學比較 HE染色：對照組小鼠皮膚組織結構完整，真皮下可見毛囊，無明顯炎癥細胞浸潤(見圖1-A)；模型組小鼠皮膚表皮棘層肥厚，真皮層明顯增厚，皮膚附屬脂肪層、肌肉層萎縮，周圍可見炎癥細胞浸潤(見圖1-B)。Masson染色：對照組小鼠皮膚膠原纖維未見明顯增生(見圖1-C)；模型組小鼠皮膚膠原纖維明顯增粗、膨大、數(shù)量增多、排列緊密、均質化(見圖1-D)。

對照組(HE染色) 模型組(HE染色) 對照組(Masson染色) 模型組(Masson染色)

2.3 兩組小鼠的肺組織病理學比較 HE染色：對照組小鼠肺部結構完整，肺泡間隔正常，無出血癥狀，支氣管壁和小血管壁厚度正常，無明顯細胞浸潤現(xiàn)象(見圖2-A)；模型組小鼠肺部結構破壞，肺泡間隔增厚，肺泡內出血,小血管壁增厚，出現(xiàn)以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤(見圖2-B)。Masson染色：對照組小鼠肺間質、肺泡和支氣管壁未見有藍色膠原纖維大量沉積(見圖2-C)；模型組小鼠肺間質、肺泡和支氣管壁纖維性增厚，膠原束在肺泡或血管內沉積，藍色膠原纖維明顯增多(見圖2-D)。

對照組(HE染色) 模型組(HE染色) 對照組(Masson染色) 模型組(Masson染色)

2.4 兩組小鼠的結腸組織病理學比較 HE染色：對照組小鼠結腸黏膜上皮完整，腺體連續(xù)，結構清晰，固有層無炎性浸潤(見圖3-A)；模型組小鼠結腸黏膜上皮結構破壞，腺體紊亂，固有層大量炎性細胞浸潤(見圖3-B)。Masson染色：對照組小鼠結腸肌層未見細胞間結合部位裂縫減少及膠原浸潤、纖維化病理改變(見圖3-C)；模型組小鼠結腸平滑肌萎縮，大量膠原浸潤，纖維化改變(見圖3-D)。

對照組(HE染色) 模型組(HE染色) 對照組(Masson染色) 模型組(Masson染色)

2.5 兩組小鼠的小腸推進率比較 模型組小鼠的小腸推進率為(45.78±4.98)%，對照組小鼠的小腸推進率為(62.13±9.00)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=5.027，P=0.000)。

3 討 論

硬皮病又稱系統(tǒng)性硬化癥，是一種慢性自身免疫性疾病，炎癥、血管病變和纖維化是其主要病理特征，最終可導致患者內臟功能喪失。硬皮病患者除表現(xiàn)為皮膚纖維化外，還會影響肺、心、腎、血管和肌肉骨骼系統(tǒng)，其并發(fā)癥最易發(fā)生在腸道系統(tǒng)，結腸和肛門直腸區(qū)域受累者約占全部患者的50%～70%，主要表現(xiàn)為腸道動力減弱、貧血、腸道出血甚至腸道穿孔，同時伴大便異常[6]。腸道穿孔具有致命性，是硬皮病患者病亡率較高的主要原因；排便功能的異常如便秘、難以控制的腹瀉等也會給患者的生活質量和精神健康造成巨大影響[7]。硬皮病患者的腸道病變部位多發(fā)生在其固有肌層,表現(xiàn)為進行性炎癥浸潤，平滑肌萎縮、破壞，肌層組織膠原浸潤和纖維化。目前硬皮病患者腸道并發(fā)癥的發(fā)病機制仍未明了，動物實驗模型的建立研究已成為硬皮病基礎研究的熱門課題[8]。

現(xiàn)有硬皮病動物模型主要有誘導型(博來霉素誘導模型、活性氧簇性氧離子誘導模型、V型膠原重塑模型等)和基因型(Fra-2轉基因小鼠、TBRICA轉基因小鼠、Cre-ER轉基因小鼠、TβRII△k轉基因小鼠、Caveolin-1轉基因小鼠等)，模型動物主要有鼠、雞、兔，其中鼠類模型的組織硬化與人類硬皮病的相似度較高。博來霉素誘導的硬皮病模型成本較低，重現(xiàn)性和維持能力較好，組織纖維化、膠原沉積、炎癥反應方面的表現(xiàn)良好，是目前造模研究的主選模型。張瑞等[9]報道，博來霉素誘導的硬皮病小鼠模型，其胃腸蠕動減慢、便秘、腹瀉方面的表現(xiàn)與臨床上硬皮病患者表現(xiàn)的吻合度約為72%。為此，本研究采用博來霉素誘導建立硬皮病小鼠模型，并對小鼠模型腸道并發(fā)癥的病理特征等進行了觀察和分析，旨為建立良好的硬皮病胃腸并發(fā)癥動物模型提供參考。

建模觀察分析結果顯示，硬皮病胃腸并發(fā)癥模型小鼠出現(xiàn)胃腸動力減退、大便干結等癥狀；小鼠皮膚表皮棘層肥厚，真皮層明顯增厚，皮膚附屬脂肪層、肌肉層萎縮，炎癥細胞浸潤，膠原纖維明顯增粗、膨大、數(shù)量增多、排列緊密、均質化；肺部結構破壞，肺泡間隔增厚，肺泡內出血,小血管壁增厚，出現(xiàn)以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，肺間質、肺泡和支氣管壁纖維性增厚，肺泡或血管內膠原束沉積，藍色膠原纖維明顯增多，微血管減少；結腸黏膜上皮結構破壞，腺體紊亂，固有層大量炎性細胞浸潤，平滑肌萎縮，大量膠原浸潤，發(fā)生纖維化改變；小腸推進率明顯降低。結果提示，博來霉素誘導建立的硬皮病小鼠模型，可有效模擬臨床硬皮病患者的腸道并發(fā)癥，為硬皮病胃腸并發(fā)癥的深入研究奠定良好基礎。