哈薩克母羊分娩前與胎兒組織器官細菌的多樣性

李曉斌，馬 晨，李鳳鳴，黃新新，米熱古麗·伊馬木，臧長江，李佳豪，李 超，馬利鑫，曹 蕊

(新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】微生物代謝在妊娠期扮演者重要角色，是確保母體和胎兒健康的關鍵[1]。妊娠期母體與胎兒之間微生物傳播研究開始增多[2-4]。研究母體與胎兒之間存在微生物傳播的可能，對深入了解這類細菌進入羊水后對胎兒胃腸道菌群多樣性的影響具有重要的意義。【前人研究進展】早期研究，新生動物腸道獲取的第一批微生物來自分娩過程母體的產道，通過第1次哺乳后不斷增加并豐富。近期，更多的研究發現，新生動物在胎兒期就已經感染一定量的微生物[5]，母體羊水并非無菌，母體與胎兒之間存在微生物傳播的可能機制[6-7]。而這種可能在妊娠小鼠及孕婦中得到了證實。Walker等[8]給懷孕的小鼠口服熒光標記糞腸球菌試驗結果顯示，其子代小鼠胎便中分離出帶標記的糞腸球菌，而對照組(未口服熒光標記糞腸球菌)小鼠子代則未檢測出熒光標記的糞腸球菌。張燁等[9]研究給孕婦服用益生菌，在子代的胎便中也可以檢測到母體服用的益生菌。【本研究切入點】當前，關于哈薩克羊母羊分娩前及胎兒相關部位細菌多樣性的研究鮮見。研究分娩前哈薩克母羊和胎兒組織、腸道內容物及相關器官菌群的多樣性。【擬解決的關鍵問題】以分娩前哈薩克妊娠母羊為研究對象，采用屠宰試驗，研究母、胎相關組織、器官菌群結構和多樣性，為進一步揭示母胎間微生物傳播的可能及調控新生羔羊腸道菌群定殖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇5只4歲、平均體重(55.64±4.37) kg的健康妊娠后期的哈薩克母羊，所有試驗動物在同一飼養環境下舍飼飼養。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

將5只妊娠后期哈薩克母羊安樂死，頸部放血，在屠宰前用無菌脫脂棉，采集母羊唾液后。根據解剖生理學，將母羊解剖，并獲取相關組織和樣品。

1.2.2 樣品采集

1.2.2.1 母羊唾液(SA)樣品采集

將無菌脫脂棉放入母羊口腔，蘸取母羊唾液后，立即裝入10 mL無菌凍存管，液氮冷凍，待測。

1.2.2.2 羊水(AF)樣品采集

將母羊解剖后，分離子宮，用50 mL的無菌注射器抽取羊水，立即轉入50 mL無菌凍存管內，液氮冷凍，待測。

1.2.2.3 臍帶(UC)樣品采集

用無菌手術剪刀剪取臍帶約10 cm，立即裝入50 mL無菌凍存管內，液氮冷凍，待測。

1.2.2.4 母羊瘤胃液(RU)樣品采集

將母羊瘤胃打開，將瘤胃內容物倒入滅菌的過濾袋內，收集濾液，混勻后，采集50 mL于無菌凍存管內，液氮冷凍，待測。

1.2.2.5 母羊小腸內容物(SI)樣品采集

分離母羊小腸，并收集全部小腸內容物于滅菌燒杯，混合均勻后，采集20 g于無菌凍存管內，液氮冷凍，待測。

1.2.2.6 母羊盲腸內容物(CE)樣品采集

分離母羊盲腸，并收集全部盲腸內容物于滅菌燒杯，混合均勻后，采集20 g于無菌凍存管內，液氮冷凍，待測。

1.2.2.7 羔羊瘤胃內容物(RF)樣品物采集

將羔羊從胎盤內剝離，解剖分離瘤胃，將全部瘤胃內容物收集于50 mL無菌凍存管內，液氮冷凍，待測。

1.2.2.8 羔羊胎糞(ME)樣品采集

分離胎兒的結腸和直腸，采集全部內容物于50 mL無菌凍存管內，液氮冷凍，待測。

1.2.3 樣品檢測

1.2.3.1 樣品DNA提取及PCR擴增

取大約0.25 g樣品采用十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)提取樣本的基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度，稀釋至1 ng/μL備用。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用16S rDNA的V4區特異引物515F和806R進行PCR擴增。

1.2.3.2 PCR產物的混樣和純化

PCR產物用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。根據PCR產物濃度進行等量混樣，混勻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收目標條帶。

1.2.3.3 文庫構建與測序

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經檢測合格后，使用Hiseq 2500 PE250上機測序。

1.3 數據處理

從下機數據中拆分出樣品數據，然后截去Barcode和引物序列用于拼接，得到的拼接序列為原始數據。參照Qiime的質量控制流程，將原始數據進行截取，并過濾掉其中連續高質量堿基長度小于序列長度75%的數據。經過以上處理后得到的序列與數據庫進行比對，檢測并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據。

利用Uparse軟件得到的有效數據進行聚類，以97%的一致性將序列聚類為OTUs(Operational Taxonomic Units)。采用RDP Classifier方法與GreenGene數據庫對OTUs代表序列進行物種注釋分析(閾值設定為0.8～1)，分別在門(Phylum)、科(Family)和屬(Genus)的分類水平上統計樣本的群落組成。

2 結果與分析

2.1 多樣性分析

研究表明，在羔羊瘤胃內容物、羔羊胎糞、羊水及母羊唾液發現數量較多的物種。母羊唾液、小腸和盲腸內容物、羊水及羔羊胎糞中有較高的shannon指數，分別為7.22、6.39、6.81、6.50、6.25。chao1和ACE指數在母羊唾液、小腸內容物和羊水中較高，分別為1 042.02、1 058.31、1 011.22和1 069.18、1 067.41、1 014.17。表1

表1 OTUs數量及α-多樣性

2.2 門水平菌群豐度

研究表明，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)在母羊和胎兒各組織器官種內容物中占比最高，細菌數量總和占菌數量的80%以上。羊水中藍細菌豐度較高為29.44%；在母羊口腔和胎兒瘤胃中變形菌門的豐度分別為41.92%和64.92%，高于母羊和胎兒其他組織器官中細菌的占比；在臍帶、羊水、胎兒瘤胃內容物和胎糞中發現了占比較高的放線菌門，分別為10.43%、8.20%、6.61%和3.44%。厚壁菌門和擬桿菌門在母羊瘤胃中分別為30.89%和51.810%，而在胎兒瘤胃中分別為10.37%和10.73%。表2

表2 門水平豐度前10的物種

2.3 科水平菌群豐度

研究表明，鞘酯菌科在胎兒瘤胃、胎糞及臍帶中有較高的豐度，分別為55.31%、9.07%和2.19%。在母羊的唾液、臍帶和胎糞中檢測到豐富的莫拉菌科，分別為25.92%、8.43%和12.01%。在母羊和胎兒所有組織器官中均檢測出較為豐富的瘤胃菌科、普雷沃氏菌科和毛螺菌科，其中瘤胃菌科在母羊小腸和盲腸內容物中分別為34.67%和41.14%，普雷沃氏菌科在母羊唾液和瘤胃液中分別為14.40%和25.32%，毛螺菌科在母羊盲腸內容物、臍帶及胎糞中分別為13.74%、8.86%和8.08%。此外，在母羊唾液中奈瑟氏菌科豐度為8.87%，母羊瘤胃液中琥珀酸弧菌科和理研菌科豐度分別為12.93%和10.43%，母羊小腸中腸桿菌科豐度為8.92%，母羊盲腸內容物中琥珀酸弧菌科豐度為8.82%。表3

表3 科水平豐度排在前10的物種豐度

2.4 屬水平菌群豐度

研究表明，在母羊唾液中檢測出豐度較高Moraxella(20.37%)、絲狀小鏈菌(5.44%)、不動細菌屬(4.28%)、單胞菌(4.29%)、鏈球菌屬(4.15%)和梭桿菌屬(3.18%)。母羊瘤胃液中檢測出豐度較高的Succinivibrio(10.04%)和unidentified_Bacteroidales(4.83%)。在母羊小腸內容物中檢測到豐度較高unidentified_Ruminococcaceae(16.50%)、Romboutsia(6.00%)和Candidatus_Saccharimonas(3.23%)。在母羊盲腸內容物中檢測到豐度較高的Succinivibrio(8.79%)、Faecalibacterium(12.45%)、擬桿菌屬(5.74%)、羅斯氏菌屬(3.84%)及Erysipelatoclostridium(2.42%)。在羔羊瘤胃液中檢測到占比55.17%Sphingomonas。在羔羊胎糞中分別檢測到豐度較高的Moraxella(5.37%)、Faecalibacterium(3.88%)、巨單胞菌屬(4.56%)、慢生根瘤菌屬(3.05%)及羅斯氏菌屬(3.32%)。在臍帶中檢測出豐度較高的嗜冷桿菌(10.11%)、Faecalibacterium(4.03%)、雙歧桿菌屬(3.75%)、肉桿菌屬(3.62%)、Jeotgalicoccus(3.65%)、擬桿菌屬(2.48%)及鏈球菌屬(4.27%)。在羊水中檢測到豐度較高的unidentified_Cyanobacteria(29.44%)、海桿菌屬(5.37%)及Ignatzschineria(3.50%)。圖1

注：嗜冷桿菌(Psychrobacter)、絲狀小鏈菌(Alysiella)、巨單胞菌屬(Megamonas)、不動細菌屬(Acinetobacter)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、肉桿菌屬(Atopostipes)、單胞菌(Porphyromonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、放線桿菌屬 (Actinobacillus)、海桿菌屬(Marinobacter)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)

2.5 類聚圖

研究表明，羔羊瘤胃液、胎糞及臍帶中物種相似性較高，母羊唾液和瘤胃液中物種相似性較高，母羊小腸內容物和母羊盲腸內容物中物種相似性較高，而羊水中物種的與其他組織相似性較低。圖2

注：分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、unidentified_Bacteria、軟壁菌門(Tenericutes)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)及螺旋體門(Spirochaetes)

3 討 論

母體微生物在一定程度上影響胎兒的發育及健康[10]，這種影響在早期的研究中認為是通過微生物代謝產生各類營養物質影響胎兒健康的[11-12]。起初研究中，認為動物胎盤、羊水是無菌的，胎盤中細菌可能是生殖道感染引起的[13-44]。Kovalovszki等[15]的研究結果首次證明母體胎盤中存在一定量的需氧細菌，并發現無任何感染的胎盤絨毛膜中仍然存在一定的細菌，胎盤及羊水中的細菌與產道是否炎癥無關。Walker等[8]及張燁等[9]研究證實母體與胎兒之間存在微生物傳播的可能。胎兒在孕期已經具備從母體獲得微生物的可能。

結果顯示，胎兒瘤胃內容物、胎糞及羊水、臍帶中均存在細菌多樣性，shannon、Simpson、chao1、ACE指數與母羊唾液、瘤胃液、小腸和盲腸內容物相似。姚雪等[16]報道，孕婦在妊娠期腸道中α-菌群多樣性降低，β-菌群多樣性升高；在陰道中α-、β-菌群多樣性均降低。試驗在母羊唾液、小腸內容物和羊水中chao1、ACE指數均在1 000以上，孕期母羊唾液、小腸內容物和羊水中菌群多樣性較高。臨產前的羔羊在母體胎盤中已經感染了一定量的微生物，母體與胎兒之間具備微生物傳播的機制，這與姚雪等[16]報道一致，妊娠期人的胎盤并非無菌，而是存在一定的耗氧菌和厭氧菌，且羊水中存在細菌已被逐漸證明。

在門水平胎兒各組織器官分別檢測到豐度較高的厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、unidentified_Bacteria、軟壁菌門(Tenericutes)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)及螺旋體門(Spirochaetes)。在母羊的小腸、盲腸內容物和臍帶中檢測到豐度較高的厚壁菌門(分別為79.08%、65.95%及49.66%)；擬桿菌門在母羊瘤胃內容物中最高為51.80%。Koren等[17]為了研究妊娠早期和后期腸道菌群豐度差異，將這2個階段腸道菌接種到無菌小鼠的腸道內，結果發現，妊娠早期腸道菌群以厚壁菌門菌(Firmicutes)和擬桿菌門菌(Bacteroidetes)為主，變形菌門比例非常少；而妊娠后期變形菌門菌豐度較高，厚壁菌門菌和擬桿菌門菌的豐度占比明顯減少。試驗中妊娠母羊唾液和胎兒瘤胃中變形菌門的豐度分別為41.92%和64.92%，相應厚壁菌門和擬桿菌門豐度降低，這一結果與Koren等研究結果不同，可能與研究對象、日糧結構類型等有關。Kovalovszki等[15]通過培養的方法，首次在胎盤樣本中發現需氧細菌，并發現即使在沒有任何絨毛膜羊膜炎組織學證據的胎盤中，細菌仍然是存在的，且胎盤微生物主要是變形菌門。胎盤微生物組成與口腔微生物最為相似，都有較高含量的普氏桿菌和奈瑟氏菌[18]。試驗結果中母羊唾液中門水平菌群豐度比例與臍帶和胎糞的相似度較高。有研究表明，革蘭陰性的口腔厭氧菌具核梭桿菌存在黏附素FadA ，它能夠與血管內皮的鈣黏蛋白結合，改變血管內皮的滲透壓，從而使得其他微生物種群，如大腸埃希菌等更輕易地穿過血管內皮屏障[19]。可以解釋口腔菌群與胎盤菌群相似性高的原因。

早期研究認為胎糞是無菌的，但最近的研究顯示，胎糞中檢測到一定量的腸球菌、腸桿菌、明串珠菌屬、乳球菌屬和鏈球菌等[20]。與成年糞便樣品菌群相比較，胎糞微生物多樣性較低，個體間的差異更高，擬桿菌門整體減少，但變形桿菌富集增加，這與試驗在胎糞中檢測到豐度較高變形菌門結果相一致。

4 結 論

母羊妊娠后期唾液、小腸內容物及羊水中有較高的chao1和ACE指數分別是104.02、1 058.31、1 011.22和1 069.18、1 067.41、1 014.17；母羊唾液中變形菌門和莫拉菌科豐度最高，分別為41.92%和25.92%；瘤胃液中擬桿菌門和普雷沃氏菌科分別為51.80%和25.32%；母羊小腸和盲腸內容物中厚壁菌門和瘤胃菌科分別為79.08%、65.95%和34.67%、41.14%；羔羊瘤胃液中變形菌門和鞘酯菌科分別為64.92%和55.31%；羔羊胎糞和臍帶中厚壁菌門分別為35.69%和49.66%。厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門是此階段母羊和胎兒各組織器官主要的物種。