不同種植地苜蓿根際土壤細菌群落結構多樣性差異分析

翟亞萍，王紹明，劉 鴦，楊 盼，張 霞，趙 祥，劉 丹

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】紫花苜蓿(MedicagosativaL.)種植產業增長空間較大[1]。研究土壤微生物多樣性，群落結構、種類組成及其功能預測，有助于闡明生物多樣性與生態系統功能之間的關系[2]。土壤細菌是土壤微生物中種類最多、數量最大、在土壤有機質分解、腐殖質形成、養分轉化與吸收等過程中起到重要作用的類群，其群落結構組成及多樣性變化是表征土壤環境質量的敏感指標[3-4]。【前人研究進展】李怡等[5]采用高通量測序技術分析了林地根際與非根際土壤細菌的物種組成、多樣性和群落結構。趙祥等[6]研究表明，滴灌增加了植物根際土壤中細菌多樣性和豐度。李文廣等[7]合理復種飼料油菜并還田可提高后茬麥田土壤養分含量及酶活性，并有效改善細菌群落多樣性。【本研究切入點】目前，新疆北疆苜蓿土壤微生物研究尚未見文獻報道。研究新疆北部不同種植地苜蓿土壤細菌群落多樣性及群落分布特征。【擬解決的關鍵問題】研究基于IonS5TMXL測序平臺進行測序，Tax4Fun功能預測進行功能分類，對新疆天山北麓石河子地區、塔城地區苜蓿土壤細菌群落結構和多樣性進行分析。分析細菌群落組成與土壤酶活性之間的關系，為研究新疆北部苜蓿土壤微生物的群落組成、物種多樣性及生態功能提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

研究區選取新疆天山北麓石河子地區、塔城地區種植苜蓿地，屬于溫帶干旱大陸性氣候區，冬季長而嚴寒，夏季短而炎熱。石河子地區年平均氣溫7～8℃，北部地區氣溫低，南部高。日照2 300～2 700 h，年均降雨量180～270 mm，年蒸發量1 000～1 500 mm。塔城地區降水量稍多，年均降雨量 290 mm，年蒸發量1 600 mm，日照2 800～3 000 h，無霜期 130～190 d。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

2018年7月在新疆石河子地區，塔城地區選取6個不同種植苜蓿地作為樣地，所取樣品分為12種土壤類型。分別在6個樣地內設置3個5 m×5 m的樣方，每個樣方內選取5～10株植株，根際土壤取樣采用“抖根法”，植物根系從土壤中挖出，抖掉與根系結合松散的土壤，收集與根系緊密結合在 4 mm的土壤作為根際土壤，在采集根際土旁選取沒有植物生長的位置采集與根際土相同深度的土壤作為非根際土壤樣品。土壤于4℃保存并盡快帶回實驗室，1份保存于-80℃，供提取土壤 DNA 進行高通量測序；另1份風干保存，用于基礎數據測定。12種土壤類型分別為紫泥泉苜蓿根際土壤(簡化為ZR)，紫泥泉苜蓿非根際土壤(ZN)，147團苜蓿根際土壤(SR)，147團苜蓿非根際土壤(SN)，沙灣縣苜蓿根際土壤(WR)，沙灣縣苜蓿非根際土壤(WN)，額敏縣苜蓿根際土壤(ER)，額敏縣苜蓿非根際土壤(EN)，托里縣苜蓿根際土壤(TR)，托里縣苜蓿非根際土壤(TN)，裕民縣苜蓿根際土壤(XR)，裕民縣苜蓿非根際土壤(XN)。表1

表1 采樣地點及樣品信息

1.2.2 土壤理化性質及酶活性

土壤理化指標的測定參考鮑士旦《土壤農化分析》中的測定方法。

1.3 數據處理

基于IonS5TMXL測序平臺，利用單端測序(Single-End)的方法，構建小片段文庫進行單端測序，測序得到的下機數據(Raw Data)進行OTUs聚類和物種分類分析。對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算等分析，得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。將高通量測序獲得的有效數據按照97%的一致性將序列聚類成為OTUs后，通過與數據庫Silva132比對，進行物種注釋，并對不同分類層級統計。進行組間差異的比較，揭示不同處理或環境下的群落結構的差異特征。將高通量測序獲得的有效數據按照97%的一致性將序列聚類成為OTUs后，通過與數據庫Silva132比對，進行物種注釋，并對不同分類層級統計發現：共有7 343個OTUs，其中，能夠注釋到數據庫的OTUs數目為7 336(99.90%)。

選取每個樣本在門分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖。根據12個土樣類型在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據其在每個樣本中的豐度信息，從物種和樣本兩個層面進行聚類，繪制成熱圖。Tax4Fun功能預測根據樣品在數據庫中的功能注釋及豐度信息，基于KEGG PATHWAY數據庫從功能差異層面進行聚類。

Tax4Fun功能預測是通過基于最小16S rRNA 序列相似度的最近鄰居法實現的，提取KEGG數據庫原核生物全基因組16S rRNA 基因序列并利用BLASTN 算法將其比對到SILVA SSU Ref NR 數據庫(BLAST bitscore >1 500)建立相關矩陣， 通過UProC和PAUDA 2種方法注釋的KEGG數據庫原核生物全基因組功能信息對應到SILVA數據庫中，實現SILVA數據庫功能注釋。測序樣品以SILVA數據庫序列為參考序列聚類出OTU，進而獲取功能注釋信息。

2 結果與分析

2.1 土壤營養成分

研究表明，石河子地區、塔城地區12種土壤類型均表現出根際土壤纖維素酶、脲酶和中性磷酸酶含量均高于非根際土壤，過氧化氫酶含量除托里縣苜蓿根際(TR)與非根際(TN)外均表現出根際土壤高于非根際土壤，蔗糖酶含量除額敏縣苜蓿根際(ER)與非根際(EN)外也均表現為根際土壤高于非根際土壤。其中除托里縣苜蓿根際(TR)與非根際(TN)過氧化氫酶含量和額敏縣苜蓿根際(ER)與非根際(EN)蔗糖酶含量外各組根際土壤與非根際土壤5種酶活性均呈現顯著性差異。表2

表2 不同土樣類型下土壤酶活性

2.2 樣品間 Alpha 多樣性

研究表明，對36個土壤樣品進行高通量測序經方法后共獲得2 581 720條高質量序列，平均長度為412 nt。各樣品文庫的覆蓋率(Coverage)均大于97.8%，各樣地的微生物物種信息得到了充分的體現，測序結果能夠真實的反映出土壤細菌群落的情況。Shannon指數、Simpson指數表現為過氧化氫酶含量較高樣地(TR、SR、ER)>過氧化氫酶含量較低樣地(WR、XR、ZR)，Chao1指數和Ace指數表現為中性磷酸酶含量較高樣地(SR、XR、ER)>中性磷酸酶含量較低樣地(WR、ZR、TR)。其中Simpson指數除額敏縣苜蓿根際(ER)與非根際(EN)外各組根際與非根際之間沒有顯著性差異，Chao1指數除紫泥泉苜蓿根際(ZR)與非根際(ZN)外各組根際與非根際之間沒有顯著性差異。表3

表3 細菌群落多樣性指數

2.3 土壤細菌多樣性指數與土壤酶活性之間的關系

研究表明，中性磷酸酶與Chao1指數、Ace指數呈顯著正相關關系；過氧化氫酶與Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和Ace指數呈負相關；Simpson指數與纖維素酶、脲酶和中性磷酸酶呈負相關關系；蔗糖酶與Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和Ace指數呈正相關關系。表4

表4 土壤細菌多樣性指數與土壤酶活性之間的相關性

2.4 細菌群落結構多樣性

研究表明，共有 7,343個OTUs，其中，能夠注釋到數據庫的OTUs數目為7,336(99.90%)，注釋到界水平的比例為99.90%，門水平的比例為91.47%，綱水平的比例為79.12%，目水平的比例為66.27%，科水平的比例為52.62%，屬水平的比例為33.45%，種水平的比例為7.42%。

在門水平上，所測12個土樣類型的序列共分屬于51個門，共同擁有的有22個門，排名前10的分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門 (Euryarchaeota) 、浮霉菌門 (Planctomycetes)和 厚壁菌門 (Firmicutes) 。門分類水平上，12個土樣類型細菌群落結構大致相同，優勢種群相似但豐度略不相同。圖1

圖1 不同土樣類型下細菌在門分類水平上的群落結構

研究表明，在屬分類水平上，測得12個土樣類型的序列共分屬于600個屬；其中12個土樣類型共同擁有的有190個屬，在群落中占比例較高的有10個屬，分別寡養單胞菌屬 (Stenotrophomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas) 、芽球菌屬( Blastococcus) 、節桿菌屬 (Arthrobacter) 、紅色桿菌屬(Rubrobacter)、unidentified_Acidobacteria、unidentified_Actinomarinales、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、Gaiella、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)。圖2

圖2 不同土樣類型下細菌在屬分類水平上的群落結構

聚類主要集中在變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和擬桿菌門(Bacteroidetes)6個門類中。各樣地根際與非根際相比：紫泥泉苜蓿根際(ZR)提高了Gaiella、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)、紅色桿菌屬(Rubrobacter)、Pelagibius的豐度；147團苜蓿根際(SR)的優勢菌屬為藤黃單胞菌屬(Luteimonassp)、Pelagibius；沙灣縣苜蓿根際(WR)提高了Polycyclovorans的豐度；額敏縣苜蓿根際(ER)的優勢菌屬為寡養單胞菌屬 (Stenotrophomonas) 、節桿菌屬 (Arthrobacter) ；托里縣苜蓿根際(TR)的優勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Stenotrophobacter、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)；裕民縣苜蓿根際(XR)提高了紅游動菌屬 (Rhodoplanes)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)豐度。圖3

圖3 不同土樣類型下細菌在屬分類水平上的熱聚類

2.5 土壤細菌群落功能預測

研究表明，紫泥泉苜蓿根際(ZR)中遺傳信息處理(Genetic_Information_Processing)、有機體系統(Organismal_Systems)功能豐度較高；147團苜蓿根際(SR)豐度較高的功能預測為新陳代謝(Metabolism)、未分類(Unclassified)、人類疾病(Human_Diseases)；沙灣縣苜蓿根際(WR)環境信息處理(Environmental_Information_Processing)、細胞過程(Cellular_Processes)、未分類(Unclassified)、人類疾病(Human_Diseases)；額敏縣苜蓿根際(ER)中細胞過程(Cellular_Processes)、人類疾病(Human_Diseases)功能豐度較高；托里縣苜蓿根際(TR)環境信息處理(Environmental_Information_Processing)、細胞過程(Cellular_Processes)、人類疾病(Human_Diseases)的豐度提高；裕民縣苜蓿根際(XR)比非根際(XN)新陳代謝(Metabolism)、未分類(Unclassified)的功能豐度提升。圖4

圖4 不同土樣類型細菌功能預測熱聚類

3 討 論

研究表明，種植苜蓿能夠明顯提高土壤酶活性，而土壤酶活性是影響土壤中微生物群落組成的因素之一[8]。土壤脲酶能夠提高土壤氮素的生物有效性；土壤蔗糖酶參與蔗糖降解；土壤中性磷酸酶催化有機磷水解, 供植物吸收；土壤過氧化氫酶可以分解土壤中對植物有害的自由基—過氧化氫；纖維素酶可以分解纖維素和木質素。研究細菌群落豐富度指數(Chao1指數和Ace指數)與土壤中性磷酸酶呈顯著正相關，說明細菌能夠提高土壤中性磷酸酶含量并且促進根際土壤磷養分的累積，而土壤中性磷酸酶的提升能夠增加細菌群落多樣性。石河子地區、塔城地區苜蓿根際土壤有著豐富的微生物資源，通過對樣品間 Alpha 多樣性分析可知，石河子地區3個樣地相較于塔城地區3個樣地細菌群落多樣性較高，但是豐富度較低。石河子地區鹽堿化程度嚴重及土地熟化程度不及塔城地區，細菌種類總數較低，不同環境條件下石河子地區、塔城地區苜蓿根際土壤的細菌優勢種群不盡相同。

在不同的12個土壤樣本中，豐度最高的為變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，這與前人研究結果一致[3]。其中放線菌門、變形菌門中的部分微生物參與土壤有機質礦化, 具有分解纖維素、半纖維素、蛋白質和木質素等功能[9]，這證實了研究中土壤纖維素酶、土壤蔗糖酶與細菌群落多樣性指數呈正相關。中性磷酸酶含量較高的樣地(SR、XR、ER)中豐度較高的為藤黃單胞菌屬(Luteimonassp) 為近年來的新發現屬，且尚未有其可產抗菌活性物質的報道[10]；Pelagibius為嗜鹽細菌，能夠適應鹽化生境[11]；紅游動菌屬 (Rhodoplanes) 可能是引起西洋參根腐病發生的關鍵菌群[12]；慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)能夠利用糖類及有機酸，但更傾向于利用戊糖，前人研究發現該屬細菌對抗生素的抗藥性比固氮根瘤菌強[13]；寡養單胞菌屬 (Stenotrophomonas)可以降解有機農藥 、進行廢水處理和污染水體的修復、部分寡養單胞菌對農藥具有生物轉化活性[14]；節桿菌屬 (Arthrobacter) 具有很強的環境適應性和抗逆性，研究發現該屬菌株具有高效降解環境中的有機污染物和吸附重金屬的能力，被用于污染水體和土壤等的生物修復研究與應用[15]。中性磷酸酶含量較低的樣地中豐度較高的為(WR、ZR、TR)紅色桿菌屬(Rubrobacter)是對于適應沙漠干旱、強輻射等極端環境具有重要作用[16]；新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium) 普遍具有降解芳烴 (芳香族) 化合物的特性是良好的芳烴污染環境的生物修復菌[17]。

在新疆北部不同樣地的苜蓿根際細菌群落一級功能層中, 中性磷酸酶含量較高的樣地(SR、XR、ER)中豐度較高的有機體系統、新陳代謝、遺傳信息處理這3類功能基因使土壤細菌代謝旺盛，從土壤中吸收營養物質，通過攝取氨基酸、能量、碳水化合物等來保證細菌的存活從而提高了細菌群落結構的多樣性[18]；中性磷酸酶含量較低的樣地(WR、TR)中環境信息處理、細胞過程功能基因豐度較高，通過這些功能基因可以從土壤中攝取更多的核苷酸、氨基酸，提高了細菌多樣性[19]。

4 結 論

細菌多樣性主要受土壤中性磷酸酶影響，根際與非根際及不同地區間，所測12個土樣類型的序列共分屬于51個門，共同擁有的有22個門，共分屬于600個屬；其中12個土樣類型共同擁有的有190個屬，細菌群落組成相似，但物種豐富度存在一定差異。土壤細菌群落功能預測中一級功能層中遺傳信息處理(Genetic_Information_Processing)、有機體系統(Organismal_Systems)、新陳代謝(Metabolism)、未分類(Unclassified)、人類疾病(Human_Diseases)、環境信息處理(Environmental_Information_Processing)、細胞過程(Cellular_Processes)豐度較高。